304 স্টেইনলেস স্টীল কয়েল টিউবিং রাসায়নিক উপাদান, SPACA6 ectodomain এর গঠনে গ্যামেট ফিউশনের সাথে যুক্ত প্রোটিনের একটি সংরক্ষিত সুপারফ্যামিলি রয়েছে।

Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি সীমিত CSS সমর্থন সহ একটি ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করছেন।সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷উপরন্তু, চলমান সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়া সাইট দেখাই।
স্লাইডার প্রতি স্লাইডে তিনটি নিবন্ধ দেখাচ্ছে৷স্লাইডগুলির মধ্য দিয়ে যেতে পিছনে এবং পরবর্তী বোতামগুলি ব্যবহার করুন, অথবা প্রতিটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যাওয়ার জন্য শেষে স্লাইড কন্ট্রোলার বোতামগুলি ব্যবহার করুন৷

SPACA6 হল একটি শুক্রাণু-প্রকাশিত পৃষ্ঠ প্রোটিন যা স্তন্যপায়ী যৌন প্রজননের সময় গ্যামেট ফিউশনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ।এই মৌলিক ভূমিকা সত্ত্বেও, SPACA6 এর নির্দিষ্ট ফাংশন খারাপভাবে বোঝা যায় না।আমরা 2.2 Å এর রেজোলিউশনে SPACA6 এর এক্সট্রা সেলুলার ডোমেনের স্ফটিক কাঠামো ব্যাখ্যা করি, একটি চার-স্ট্রান্ডেড বান্ডেল এবং Ig-এর মতো β-স্যান্ডউইচগুলি আধা-নমনীয় লিঙ্কার দ্বারা যুক্ত একটি দ্বি-ডোমেন প্রোটিন প্রকাশ করে।এই কাঠামোটি IZUMO1-এর সাথে সাদৃশ্যপূর্ণ, আরেকটি গ্যামেট ফিউশন-সম্পর্কিত প্রোটিন, SPACA6 এবং IZUMO1-কে এখানে IST সুপারফ্যামিলি হিসাবে উল্লেখ করা নিষিক্ত-সম্পর্কিত প্রোটিনের সুপারফ্যামিলির প্রতিষ্ঠাতা সদস্য করে।IST সুপারফ্যামিলি গঠনগতভাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে এর টুইস্টেড ফোর-হেলিক্স বান্ডিল এবং একজোড়া ডিসালফাইড-লিঙ্কড CXXC মোটিফ দ্বারা।মানব প্রোটিওমের গঠন-ভিত্তিক আলফাফোল্ড অনুসন্ধান এই অতিপরিবারের অতিরিক্ত প্রোটিন সদস্যদের চিহ্নিত করেছে;উল্লেখযোগ্যভাবে, এই প্রোটিনগুলির মধ্যে অনেকগুলি গেমেট ফিউশনের সাথে জড়িত।SPACA6 কাঠামো এবং IST-এর অন্যান্য সদস্যদের সাথে এর সম্পর্ক সুপারফ্যামিলি স্তন্যপায়ী গেমেট ফিউশন সম্পর্কে আমাদের জ্ঞানের অনুপস্থিত লিঙ্ক প্রদান করে।
প্রতিটি মানুষের জীবন দুটি পৃথক হ্যাপ্লয়েড গ্যামেট দিয়ে শুরু হয়: পিতার শুক্রাণু এবং মায়ের ডিম্বাণু।এই শুক্রাণু একটি তীব্র বাছাই প্রক্রিয়ার বিজয়ী যার সময় লক্ষ লক্ষ শুক্রাণু কোষ নারীর যৌনাঙ্গের মধ্য দিয়ে যায়, বিভিন্ন বাধা অতিক্রম করে এবং ক্যাপাসিটেশনের মধ্য দিয়ে যায়, যা তাদের গতিশীলতা এবং পৃষ্ঠের উপাদানগুলির প্রক্রিয়াকে বৃদ্ধি করে 2,3,4।এমনকি শুক্রাণু এবং oocyte একে অপরকে খুঁজে পেলেও, প্রক্রিয়াটি এখনও শেষ হয়নি।ওসাইটটি কিউমুলাস কোষের একটি স্তর এবং জোনা পেলুসিডা নামক একটি গ্লাইকোপ্রোটিন বাধা দ্বারা বেষ্টিত, যার মধ্য দিয়ে শুক্রাণুকে অবশ্যই ওসাইটে প্রবেশ করতে হবে।স্পার্মাটোজোয়া এই চূড়ান্ত বাধাগুলি অতিক্রম করতে পৃষ্ঠের আনুগত্য অণু এবং ঝিল্লি-সম্পর্কিত এবং নিঃসৃত এনজাইমগুলির সংমিশ্রণ ব্যবহার করে।এই অণু এবং এনজাইমগুলি মূলত অভ্যন্তরীণ ঝিল্লি এবং অ্যাক্রোসোমাল ম্যাট্রিক্সে সঞ্চিত থাকে এবং অ্যাক্রোসোমাল প্রতিক্রিয়ার সময় শুক্রাণুর বাইরের ঝিল্লি লাইজড হলে সনাক্ত করা হয়।এই তীব্র যাত্রার চূড়ান্ত ধাপ হল শুক্রাণু-ডিম্বাণু সংযোজন ঘটনা, যেখানে দুটি কোষ তাদের ঝিল্লিকে একক ডিপ্লয়েড জীবে পরিণত করে7।যদিও এই প্রক্রিয়াটি মানুষের প্রজননে যুগান্তকারী, প্রয়োজনীয় আণবিক মিথস্ক্রিয়াগুলি খুব কম বোঝা যায় না।
গেমেটের নিষিক্তকরণের পাশাপাশি, দুটি লিপিড বিলেয়ারের ফিউশনের রসায়ন ব্যাপকভাবে অধ্যয়ন করা হয়েছে।সাধারণভাবে, মেমব্রেন ফিউশন হল একটি এনার্জেটিকভাবে প্রতিকূল প্রক্রিয়া যার জন্য একটি প্রোটিন অনুঘটকের প্রয়োজন একটি কাঠামোগত পরিবর্তনের জন্য যা দুটি ঝিল্লিকে কাছাকাছি নিয়ে আসে, তাদের ধারাবাহিকতা ভেঙে দেয় এবং ফিউশন 8,9 ঘটায়।এই প্রোটিন অনুঘটকগুলি ফুসোজেন হিসাবে পরিচিত এবং অগণিত ফিউশন সিস্টেমে পাওয়া গেছে।হোস্ট কোষে ভাইরাল প্রবেশের জন্য এগুলি প্রয়োজন (যেমন, এইচআইভি-১-এ gp160, করোনাভাইরাসে স্পাইক, ইনফ্লুয়েঞ্জা ভাইরাসে হেমাগ্লুটিনিন) 10,11,12 প্ল্যাসেন্টাল (সিনসিটিন) 13,14,15 এবং নিম্ন ইউক্যারিওটে গেমেট-গঠন ফিউশন ( উদ্ভিদ, প্রোটিস্ট এবং আর্থ্রোপডগুলিতে HAP2/GCS1) 16,17,18,19।মানব গ্যামেটের জন্য ফুসোজেন এখনও আবিষ্কৃত হয়নি, যদিও বেশ কয়েকটি প্রোটিন গেমেট সংযুক্তি এবং ফিউশনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ বলে দেখানো হয়েছে।oocyte-expressed CD9, একটি ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন যা মাউস এবং মানব গ্যামেটের ফিউশনের জন্য প্রয়োজনীয়, এটি 21,22,23টি প্রথম আবিষ্কৃত হয়েছিল।যদিও এর সুনির্দিষ্ট কার্যকারিতা অস্পষ্ট থেকে যায়, আনুগত্যের একটি ভূমিকা, ডিমের মাইক্রোভিলিতে আনুগত্য কেন্দ্রের গঠন এবং/অথবা ওসাইট পৃষ্ঠের প্রোটিনের সঠিক স্থানীয়করণ সম্ভবত 24,25,26 বলে মনে হয়।গেমেট ফিউশনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ দুটি সাধারণ প্রোটিন হল শুক্রাণু প্রোটিন IZUMO127 এবং oocyte প্রোটিন JUNO28, এবং তাদের পারস্পরিক সম্পর্ক ফিউশনের আগে গেমেট স্বীকৃতি এবং আনুগত্যের একটি গুরুত্বপূর্ণ পদক্ষেপ।পুরুষ ইজুমো 1 নকআউট ইঁদুর এবং মহিলা জুনো নকআউট ইঁদুরগুলি সম্পূর্ণ জীবাণুমুক্ত, এই মডেলগুলিতে শুক্রাণু পেরিভিটেলাইন স্পেসে প্রবেশ করে তবে গেমেটগুলি ফিউজ করে না।একইভাবে, মানুষের মধ্যে ভিট্রো ফার্টিলাইজেশন পরীক্ষায় অ্যান্টি-IZUMO1 বা JUNO27,29 অ্যান্টিবডি দিয়ে গ্যামেটগুলিকে চিকিত্সা করার সময় সঙ্গম হ্রাস করা হয়েছিল।
সম্প্রতি, IZUMO1 এবং JUNO20,30,31,32,33,34,35-এর মতো ফেনোটাইপিকভাবে অনুরূপ শুক্রাণু-প্রকাশিত প্রোটিনের একটি নতুন আবিষ্কৃত গ্রুপ আবিষ্কৃত হয়েছে।স্পার্ম অ্যাক্রোসোমাল মেমব্রেন-সম্পর্কিত প্রোটিন 6 (SPACA6) একটি বৃহৎ মাপের মুরিন মিউটেজেনেসিস গবেষণায় নিষিক্তকরণের জন্য অপরিহার্য হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছে।Spaca6 জিনে ট্রান্সজিন সন্নিবেশ করায় অ-ফিউজিবল স্পার্মাটোজোয়া উৎপন্ন হয়, যদিও এই স্পার্মাটোজোয়া পেরিভিটেলাইন স্পেসে অনুপ্রবেশ করে 36।ইঁদুরের পরবর্তী নকআউট গবেষণা নিশ্চিত করেছে যে গেমেট ফিউশন 30,32 এর জন্য Spaca6 প্রয়োজন।SPACA6 প্রায় একচেটিয়াভাবে অণ্ডকোষে প্রকাশ করা হয় এবং এটি IZUMO1 এর মতো স্থানীয়করণ প্যাটার্ন রয়েছে, যেমন অ্যাক্রোসোমাল প্রতিক্রিয়ার আগে শুক্রাণুর অন্তরের মধ্যে, এবং তারপর অ্যাক্রোসোমাল প্রতিক্রিয়া 30,32 এর পরে নিরক্ষীয় অঞ্চলে স্থানান্তরিত হয়।বিভিন্ন ধরনের স্তন্যপায়ী প্রাণী এবং অন্যান্য ইউক্যারিওট 30 এর মধ্যে Spaca6 হোমোলগ বিদ্যমান এবং মানুষের গ্যামেট ফিউশনের জন্য এর গুরুত্ব SPACA6 30 এর প্রতিরোধের দ্বারা ভিট্রোতে মানব নিষিক্তকরণের বাধা দ্বারা প্রদর্শিত হয়েছে।IZUMO1 এবং JUNO এর বিপরীতে, SPACA6 এর গঠন, মিথস্ক্রিয়া এবং কার্যকারিতার বিবরণ অস্পষ্ট থেকে যায়।
মানুষের শুক্রাণু এবং ডিমের ফিউশনের অন্তর্নিহিত মৌলিক প্রক্রিয়াটি আরও ভালভাবে বোঝার জন্য, যা আমাদের পরিবার পরিকল্পনা এবং উর্বরতা চিকিত্সার ভবিষ্যত উন্নয়ন সম্পর্কে জানাতে সক্ষম করবে, আমরা SPACA6 কাঠামোগত এবং জৈব রাসায়নিক গবেষণা পরিচালনা করেছি।SPACA6 এর এক্সট্রা সেলুলার ডোমেনের স্ফটিক কাঠামো একটি চার-হেলিকাল বান্ডেল (4HB) এবং একটি ইমিউনোগ্লোবুলিন-এর মতো (Ig-এর মতো) ডোমেনকে আধা-নমনীয় অঞ্চল দ্বারা সংযুক্ত দেখায়।পূর্ববর্তী গবেষণায় ভবিষ্যদ্বাণী করা হয়েছে, 7,32,37 SPACA6 এর ডোমেন গঠন মানুষের IZUMO1 এর মতো, এবং দুটি প্রোটিন একটি অস্বাভাবিক মোটিফ ভাগ করে: 4HB একটি ত্রিভুজাকার হেলিকাল পৃষ্ঠ এবং একজোড়া ডিসালফাইড-সংযুক্ত CXXC মোটিফের সাথে।আমরা প্রস্তাব করি যে IZUMO1 এবং SPACA6 এখন গ্যামেট ফিউশনের সাথে যুক্ত প্রোটিনের একটি বৃহত্তর, কাঠামোগতভাবে সম্পর্কিত সুপারফ্যামিলিকে সংজ্ঞায়িত করে।সুপারফ্যামিলির জন্য অনন্য বৈশিষ্ট্যগুলি ব্যবহার করে, আমরা আলফাফোল্ড স্ট্রাকচারাল হিউম্যান প্রোটিওমের জন্য একটি বিস্তৃত অনুসন্ধান পরিচালনা করেছি, এই সুপারফ্যামিলির অতিরিক্ত সদস্যদের শনাক্ত করেছি, যার মধ্যে গেমেট ফিউশন এবং/অথবা নিষেকের সাথে জড়িত বেশ কয়েকটি সদস্য রয়েছে৷এটি এখন দেখা যাচ্ছে যে গ্যামেট ফিউশনের সাথে যুক্ত প্রোটিনের একটি সাধারণ কাঠামোগত ভাঁজ এবং অতিপরিবার রয়েছে এবং আমাদের কাঠামো মানব গেমেট ফিউশন প্রক্রিয়ার এই গুরুত্বপূর্ণ দিকটির একটি আণবিক মানচিত্র সরবরাহ করে।
SPACA6 হল একটি একক-পাস ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন যার একটি এন-লিঙ্কযুক্ত গ্লাইকান এবং ছয়টি পুটেটিভ ডিসালফাইড বন্ড (চিত্র S1a এবং S2)।আমরা ড্রোসোফিলা এস 2 কোষে মানব SPACA6 (অবশিষ্ট 27-246) এর বহির্মুখী ডোমেন প্রকাশ করেছি এবং নিকেল অ্যাফিনিটি, ক্যাটেশন এক্সচেঞ্জ এবং আকার বর্জন ক্রোমাটোগ্রাফি (চিত্র S1b) ব্যবহার করে প্রোটিনকে বিশুদ্ধ করেছি।বিশুদ্ধ SPACA6 ইক্টোডোমেন খুবই স্থিতিশীল এবং একজাত।বহুভুজ আলো বিচ্ছুরণ (SEC-MALS) এর সাথে মিলিত আকার বর্জন ক্রোমাটোগ্রাফি ব্যবহার করে বিশ্লেষণে 26.2 ± 0.5 kDa (চিত্র S1c) এর গণনাকৃত আণবিক ওজন সহ একটি শিখর প্রকাশ করেছে।এটি SPACA6 মনোমেরিক ইক্টোডোমেনের আকারের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা ইঙ্গিত করে যে শোধনের সময় অলিগোমারাইজেশন ঘটেনি।উপরন্তু, বৃত্তাকার ডাইক্রোইজম (CD) বর্ণালী 51.3 °C (চিত্র S1d,e) এর গলনাঙ্ক সহ একটি মিশ্র α/β গঠন প্রকাশ করেছে।সিডি স্পেকট্রার ডিকনভোলিউশন 38.6% α-হেলিকাল এবং 15.8% β-স্ট্র্যান্ডেড উপাদান (চিত্র S1d) প্রকাশ করেছে।
SPACA6 ectodomain র্যান্ডম ম্যাট্রিক্স seeding38 ব্যবহার করে ক্রিস্টালাইজ করা হয়েছিল যার ফলে 2.2 Å (সারণী 1 এবং চিত্র S3) এর রেজোলিউশন সহ একটি ডেটা সেট তৈরি হয়েছিল।কাঠামো নির্ধারণের জন্য ব্রোমাইড এক্সপোজারের সাথে ফ্র্যাগমেন্ট-ভিত্তিক আণবিক প্রতিস্থাপন এবং SAD ফেজিং ডেটার সংমিশ্রণ ব্যবহার করে (সারণী 1 এবং চিত্র S4), চূড়ান্ত পরিমার্জিত মডেলটি 27-246 অবশিষ্টাংশ নিয়ে গঠিত।যখন কাঠামোটি নির্ধারণ করা হয়েছিল, তখন কোনও পরীক্ষামূলক বা আলফাফোল্ড কাঠামো উপলব্ধ ছিল না।SPACA6 ইক্টোডোমেন পরিমাপ 20 Å × 20 Å × 85 Å, সাতটি হেলিস এবং নয়টি β-স্ট্র্যান্ড নিয়ে গঠিত এবং ছয়টি ডিসালফাইড বন্ড দ্বারা স্থিতিশীল একটি দীর্ঘায়িত তৃতীয় ভাঁজ রয়েছে (চিত্র 1a, b)।Asn243 সাইড চেইনের শেষে দুর্বল ইলেকট্রন ঘনত্ব নির্দেশ করে যে এই অবশিষ্টাংশটি একটি N-সংযুক্ত গ্লাইকোসিলেশন।কাঠামোটি দুটি ডোমেন নিয়ে গঠিত: একটি N-টার্মিনাল ফোর-হেলিক্স বান্ডেল (4HB) এবং একটি C-টার্মিনাল Ig-এর মতো ডোমেন যার মধ্যে একটি মধ্যবর্তী কব্জা অঞ্চল রয়েছে (চিত্র 1c)।
SPACA6 এর এক্সট্রা সেলুলার ডোমেনের একটি কাঠামো।SPACA6 এর এক্সট্রা সেলুলার ডোমেনের স্ট্রিপ ডায়াগ্রাম, N থেকে C-টার্মিনাস পর্যন্ত চেইনের রঙ গাঢ় নীল থেকে গাঢ় লাল।ডাইসালফাইড বন্ডের সাথে জড়িত সিস্টাইনগুলি ম্যাজেন্টাতে হাইলাইট করা হয়।b SPACA6 এর এক্সট্রা সেলুলার ডোমেনের টপোলজি।চিত্র 1a এর মতো একই রঙের স্কিম ব্যবহার করুন।c SPACA6 এক্সট্রা সেলুলার ডোমেইন।4HB, কব্জা, এবং Ig-এর মতো ডোমেন স্ট্রিপ চার্টগুলি যথাক্রমে কমলা, সবুজ এবং নীল রঙের।স্তর স্কেল আঁকা হয় না.
SPACA6-এর 4HB ডোমেনে চারটি প্রধান হেলিস (হেলিসেস 1-4) অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, যেগুলি একটি হেলিকাল হেলিক্স (চিত্র 2a) আকারে সাজানো হয়েছে, যা সমান্তরাল এবং সমান্তরাল মিথস্ক্রিয়াগুলির মধ্যে পর্যায়ক্রমে (চিত্র 2b)।একটি ছোট অতিরিক্ত একক-টার্ন হেলিক্স (হেলিক্স 1′) বান্ডিলের সাথে লম্বভাবে স্থাপন করা হয়, হেলিস 1 এবং 2 সহ একটি ত্রিভুজ গঠন করে। এই ত্রিভুজটি হেলিক্স 3 এবং 4-এর তুলনামূলকভাবে ঘন প্যাকিংয়ের হেলিকাল-টুইস্টেড প্যাকিংয়ে সামান্য বিকৃত হয় ( চিত্র 2a)।
4HB N-টার্মিনাল স্ট্রিপ চার্ট।b চারটি হেলিসের বান্ডিলের শীর্ষ দৃশ্য, প্রতিটি হেলিক্স এন-টার্মিনাসে গাঢ় নীল এবং সি-টার্মিনাসে গাঢ় লালে হাইলাইট করা হয়েছে।c 4HB-এর জন্য টপ-ডাউন স্পাইরাল হুইল ডায়াগ্রাম, প্রতিটি অবশিষ্টাংশকে একটি একক-অক্ষরের অ্যামিনো অ্যাসিড কোড দিয়ে লেবেলযুক্ত একটি বৃত্ত হিসাবে দেখানো হয়েছে;চাকার শীর্ষে শুধুমাত্র চারটি অ্যামিনো অ্যাসিড সংখ্যাযুক্ত।অ-পোলার অবশিষ্টাংশগুলি হলুদ রঙের, পোলার আনচার্জড অবশিষ্টাংশগুলি রঙিন সবুজ, ধনাত্মক চার্জযুক্ত অবশিষ্টাংশগুলি রঙিন নীল এবং নেতিবাচকভাবে চার্জযুক্ত অবশিষ্টাংশগুলি লাল রঙের হয়।d 4HB ডোমেনের ত্রিভুজাকার মুখ, 4HB কমলা এবং কব্জায় সবুজ।উভয় ইনসেট রড-আকৃতির ডিসালফাইড বন্ধন দেখায়।
4HB একটি অভ্যন্তরীণ হাইড্রোফোবিক কোরে কেন্দ্রীভূত হয় যা মূলত আলিফ্যাটিক এবং সুগন্ধযুক্ত অবশিষ্টাংশ (চিত্র 2c) দ্বারা গঠিত।কোরটিতে Cys41 এবং Cys55 এর মধ্যে একটি ডিসালফাইড বন্ধন রয়েছে যা একটি উপরের উত্থিত ত্রিভুজ (চিত্র 2d) এ হেলিস 1 এবং 2 কে একসাথে সংযুক্ত করে।হেলিক্স 1′-এ CXXC মোটিফের মধ্যে দুটি অতিরিক্ত ডিসালফাইড বন্ড তৈরি হয়েছিল এবং কবজা অঞ্চলে β-হেয়ারপিনের ডগায় পাওয়া আরেকটি CXXC মোটিফ (চিত্র 2d)।একটি অজানা ফাংশন (Arg37) সহ একটি রক্ষণশীল আর্জিনাইন অবশিষ্টাংশ হেলিস 1′, 1, এবং 2 দ্বারা গঠিত একটি ফাঁপা ত্রিভুজের ভিতরে অবস্থিত। আলিফ্যাটিক কার্বন পরমাণু Cβ, Cγ এবং Cδ Arg37 হাইড্রোফোবিক কোরের সাথে যোগাযোগ করে এবং এর গুয়ানিডিন গ্রুপগুলি চক্রাকারে চলাচল করে। Helices 1′ এবং 1 এর মধ্যে Thr32 ব্যাকবোন এবং সাইড চেইন (চিত্র S5a,b) এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া মাধ্যমে।Tyr34 দুটি ছোট গহ্বর রেখে গহ্বরের মধ্যে প্রসারিত হয় যার মাধ্যমে Arg37 দ্রাবকের সাথে যোগাযোগ করতে পারে।
Ig-এর মতো β-স্যান্ডউইচ ডোমেনগুলি হল প্রোটিনের একটি বৃহৎ সুপারফ্যামিলি যা দুটি বা ততোধিক মাল্টি-স্ট্র্যান্ডেড অ্যাম্ফিপ্যাথিক β-শীটগুলির সাধারণ বৈশিষ্ট্যগুলিকে একটি হাইড্রোফোবিক কোরের মাধ্যমে ইন্টারঅ্যাক্ট করে 39৷ SPACA6-এর C-টার্মিনাল Ig-সদৃশ ডোমেনের একই প্যাটার্ন রয়েছে এবং দুটি স্তর নিয়ে গঠিত (চিত্র S6a)।পত্রক 1 হল চারটি স্ট্র্যান্ডের একটি β-শীট ​​(স্ট্র্যান্ড D, F, H, এবং I) যেখানে স্ট্র্যান্ড F, H, এবং I একটি সমান্তরাল বিরোধী বিন্যাস তৈরি করে, এবং স্ট্র্যান্ড I এবং D একটি সমান্তরাল মিথস্ক্রিয়া গ্রহণ করে।সারণি 2 হল একটি ছোট অ্যান্টি-প্যারালাল ডবল-স্ট্র্যান্ডেড বিটা শীট (স্ট্র্যান্ড E এবং G)।ই চেইনের সি-টার্মিনাস এবং এইচ চেইন (Cys170-Cys226) (চিত্র S6b) এর কেন্দ্রের মধ্যে একটি অভ্যন্তরীণ ডিসালফাইড বন্ধন পরিলক্ষিত হয়েছে।এই ডিসালফাইড বন্ডটি ইমিউনোগ্লোবুলিন 40,41-এর β-স্যান্ডউইচ ডোমেনের ডাইসলফাইড বন্ডের সাথে সাদৃশ্যপূর্ণ।
ফোর-স্ট্র্যান্ড β-শীটটি তার সমগ্র দৈর্ঘ্য বরাবর পেঁচিয়ে অপ্রতিসম প্রান্ত তৈরি করে যা আকৃতি এবং ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক্সে ভিন্ন।পাতলা প্রান্ত হল একটি সমতল হাইড্রোফোবিক পরিবেশগত পৃষ্ঠ যা SPACA6 (চিত্র S6b,c) এর অবশিষ্ট অসম এবং বৈদ্যুতিকভাবে বৈচিত্র্যময় পৃষ্ঠের তুলনায় আলাদা।উন্মুক্ত ব্যাকবোন কার্বনিল/অ্যামিনো গ্রুপ এবং পোলার সাইড চেইনের একটি হ্যালো হাইড্রোফোবিক পৃষ্ঠকে ঘিরে রয়েছে (চিত্র S6c)।বৃহত্তর মার্জিনটি একটি ক্যাপড হেলিকাল সেগমেন্ট দ্বারা আবৃত যা হাইড্রোফোবিক কোরের এন-টার্মিনাল অংশকে ব্লক করে এবং F চেইন ব্যাকবোনের উন্মুক্ত পোলার গ্রুপের সাথে তিনটি হাইড্রোজেন বন্ধন গঠন করে (চিত্র S6d)।এই প্রান্তের সি-টার্মিনাল অংশটি একটি আংশিকভাবে উন্মুক্ত হাইড্রোফোবিক কোর সহ একটি বড় পকেট গঠন করে।পকেটটি ধনাত্মক চার্জ দ্বারা বেষ্টিত থাকে যার কারণে তিনটি ডাবল আর্জিনাইন অবশিষ্টাংশ (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 এবং Arg212-Arg214) এবং একটি কেন্দ্রীয় হিস্টিডিন (His220) (চিত্র S6e)।
কব্জা অঞ্চল হল হেলিকাল ডোমেইন এবং Ig-এর মতো ডোমেনের মধ্যে একটি ছোট অংশ, যেখানে একটি অ্যান্টি-প্যারালাল থ্রি-স্ট্র্যান্ডেড β-স্তর (স্ট্র্যান্ড A, B এবং C), একটি ছোট 310 হেলিক্স এবং বেশ কয়েকটি দীর্ঘ এলোমেলো হেলিকাল অংশ রয়েছে।(চিত্র S7)।কব্জা অঞ্চলে সমযোজী এবং ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক যোগাযোগের একটি নেটওয়ার্ক 4HB এবং Ig-এর মতো ডোমেনের মধ্যে ওরিয়েন্টেশনকে স্থিতিশীল করে বলে মনে হচ্ছে।নেটওয়ার্ককে তিন ভাগে ভাগ করা যায়।প্রথম অংশে দুটি CXXC মোটিফ (27CXXC30 এবং 139CXXC142) রয়েছে যা কব্জায় থাকা β-হেয়ারপিন এবং 4HB-তে 1′ হেলিক্সের মধ্যে এক জোড়া ডাইসলফাইড বন্ধন তৈরি করে।দ্বিতীয় অংশে Ig-এর মতো ডোমেন এবং কব্জাগুলির মধ্যে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া অন্তর্ভুক্ত রয়েছে।কব্জায় থাকা Glu132 Ig-এর মতো ডোমেনে Arg233 এবং কব্জায় Arg135 এর সাথে একটি লবণের সেতু তৈরি করে।তৃতীয় অংশে আইজি-এর মতো ডোমেন এবং কব্জা অঞ্চলের মধ্যে একটি সমযোজী বন্ধন অন্তর্ভুক্ত রয়েছে।দুটি ডিসালফাইড বন্ড (Cys124-Cys147 এবং Cys128-Cys153) কব্জা লুপটিকে একটি লিঙ্কারের সাথে সংযুক্ত করে যা Gln131 এবং ব্যাকবোন ফাংশনাল গ্রুপের মধ্যে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া দ্বারা স্থিতিশীল হয়, যা প্রথম Ig-এর মতো ডোমেনে অ্যাক্সেসের অনুমতি দেয়।চেইন
SPACA6 ইক্টোডোমেনের কাঠামো এবং 4HB এবং Ig-এর মতো ডোমেনের পৃথক কাঠামো প্রোটিন ডাটাবেস 42-এ কাঠামোগতভাবে অনুরূপ রেকর্ডগুলি অনুসন্ধান করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।আমরা উচ্চ ডালি জেড স্কোর, ছোট স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি এবং বড় LALI স্কোর (পরবর্তীটি কাঠামোগতভাবে সমতুল্য অবশিষ্টাংশের সংখ্যা) সহ ম্যাচগুলি চিহ্নিত করেছি।সম্পূর্ণ ইক্টোডোমেন অনুসন্ধান (টেবিল এস1) থেকে প্রথম 10টি হিটের একটি গ্রহণযোগ্য Z-স্কোর >842 ছিল, শুধুমাত্র 4HB বা Ig-এর মতো ডোমেনের অনুসন্ধানে দেখা গেছে যে এই হিটগুলির বেশিরভাগই শুধুমাত্র β-স্যান্ডউইচগুলির সাথে সম্পর্কিত।অনেক প্রোটিনের মধ্যে একটি সর্বব্যাপী ভাঁজ পাওয়া যায়।ডালিতে তিনটি অনুসন্ধানই শুধুমাত্র একটি ফলাফল দিয়েছে: IZUMO1।
এটি দীর্ঘদিন ধরে সুপারিশ করা হয়েছে যে SPACA6 এবং IZUMO1 কাঠামোগত মিল 7,32,37 ভাগ করে।যদিও এই দুটি গেমেট ফিউশন-সম্পর্কিত প্রোটিনের ইক্টোডোমেনগুলি কেবলমাত্র 21% সিকোয়েন্স আইডেন্টিটি (চিত্র S8a) ভাগ করে, জটিল প্রমাণ, যার মধ্যে একটি সংরক্ষিত ডিসালফাইড বন্ড প্যাটার্ন এবং SPACA6-তে একটি পূর্বাভাসিত সি-টার্মিনাল আইজি-সদৃশ ডোমেন রয়েছে, প্রাথমিক প্রয়াস তৈরির অনুমতি দেয়। একটি টেমপ্লেট হিসাবে IZUMO1 ব্যবহার করে একটি SPACA6 মাউসের হোমোলজি মডেল37৷আমাদের কাঠামো এই ভবিষ্যদ্বাণীগুলি নিশ্চিত করে এবং সাদৃশ্যের সত্য ডিগ্রি দেখায়।প্রকৃতপক্ষে, SPACA6 এবং IZUMO137,43,44 কাঠামো একই দুই-ডোমেন আর্কিটেকচার (চিত্র S8b) একই 4HB এবং Ig-এর মতো β-স্যান্ডউইচ ডোমেনগুলির সাথে একটি কব্জা অঞ্চল (চিত্র S8c) দ্বারা সংযুক্ত।
IZUMO1 এবং SPACA6 4HB-এর প্রচলিত সর্পিল বান্ডিল থেকে সাধারণ পার্থক্য রয়েছে।সাধারণ 4HB, যেমন এন্ডোসোমাল ফিউশন 45,46 এর সাথে জড়িত SNARE প্রোটিন কমপ্লেক্সে পাওয়া যায়, সমানভাবে ব্যবধানযুক্ত হেলিসগুলি একটি কেন্দ্রীয় অক্ষ 47 এর চারপাশে একটি ধ্রুবক বক্রতা বজায় রাখে। বিপরীতে, IZUMO1 এবং SPACA6 উভয়ের হেলিকাল ডোমেনগুলি বিকৃত ছিল, পরিবর্তনশীল বক্রতা সহ। অসম প্যাকিং (চিত্র S8d)।মোচড়, সম্ভবতঃ হেলিক্স 1′, 1 এবং 2 দ্বারা গঠিত ত্রিভুজ দ্বারা সৃষ্ট, IZUMO1 এবং SPACA6-এ ধরে রাখা হয়েছে এবং হেলিক্স 1′-এ একই CXXC মোটিফ দ্বারা স্থির করা হয়েছে।যাইহোক, SPACA6 তে পাওয়া অতিরিক্ত ডিসালফাইড বন্ড (Cys41 এবং Cys55 সহযোগে হেলিস 1 এবং 2 উপরে সংযুক্ত করে) ত্রিভুজ শীর্ষে একটি তীক্ষ্ণ শীর্ষ তৈরি করে, যা SPACA6 কে IZUMO1 এর চেয়ে আরও সুস্পষ্ট করে, আরও উচ্চারিত গহ্বর ত্রিভুজ সহ।উপরন্তু, IZUMO1 এ SPACA6-এ এই গহ্বরের কেন্দ্রে পর্যবেক্ষণ করা Arg37-এর অভাব রয়েছে।বিপরীতে, IZUMO1-এ অ্যালিফ্যাটিক এবং সুগন্ধযুক্ত অবশিষ্টাংশের আরও সাধারণ হাইড্রোফোবিক কোর রয়েছে।
IZUMO1-এর একটি Ig-এর মতো ডোমেন রয়েছে যাতে একটি ডবল-স্ট্র্যান্ডেড এবং ফাইভ-স্ট্র্যান্ডেড β-শীট43 থাকে।IZUMO1-এর অতিরিক্ত স্ট্র্যান্ড SPACA6-এ কয়েলটিকে প্রতিস্থাপন করে, যা F স্ট্র্যান্ডের সাথে স্ট্র্যান্ডের ব্যাকবোন হাইড্রোজেন বন্ডকে সীমিত করতে ইন্টারঅ্যাক্ট করে।তুলনার একটি আকর্ষণীয় বিষয় হল দুটি প্রোটিনের Ig-এর মতো ডোমেনের পূর্বাভাসিত পৃষ্ঠ চার্জ।IZUMO1 পৃষ্ঠটি SPACA6 পৃষ্ঠের চেয়ে বেশি ঋণাত্মক চার্জযুক্ত।একটি অতিরিক্ত চার্জ সি-টার্মিনাসের কাছে শুক্রাণু ঝিল্লির মুখোমুখি হয়।SPACA6-এ, একই অঞ্চলগুলি আরও নিরপেক্ষ বা ধনাত্মক চার্জযুক্ত ছিল (চিত্র S8e)।উদাহরণস্বরূপ, SPACA6-এ হাইড্রোফোবিক পৃষ্ঠ (পাতলা প্রান্ত) এবং ধনাত্মক চার্জযুক্ত পিট (প্রশস্ত প্রান্ত) IZUMO1-এ ঋণাত্মকভাবে চার্জ করা হয়েছে।
যদিও IZUMO1 এবং SPACA6-এর মধ্যে সম্পর্ক এবং গৌণ কাঠামোর উপাদানগুলি ভালভাবে সংরক্ষিত আছে, Ig-এর মতো ডোমেনের কাঠামোগত প্রান্তিককরণ দেখায় যে দুটি ডোমেন একে অপরের তুলনায় তাদের সাধারণ অভিযোজনে পৃথক (চিত্র S9)।IZUMO1-এর সর্পিল বান্ডিলটি β-স্যান্ডউইচের চারপাশে বাঁকা, কেন্দ্রীয় অক্ষ থেকে প্রায় 50° এ পূর্বে বর্ণিত "বুমেরাং" আকৃতি তৈরি করে।বিপরীতে, SPACA6 এর হেলিকাল বিমটি বিপরীত দিকে প্রায় 10° কাত ছিল।কবজা অঞ্চলের পার্থক্যের কারণে এই অভিযোজনগুলির পার্থক্য সম্ভবত।প্রাথমিক ক্রম স্তরে, IZUMO1 এবং SPACA6 সিস্টাইন, গ্লাইসিন এবং অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডের অবশিষ্টাংশগুলি বাদ দিয়ে কব্জায় সামান্য অনুক্রমের মিল রয়েছে।ফলস্বরূপ, হাইড্রোজেন বন্ড এবং ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক নেটওয়ার্ক সম্পূর্ণ আলাদা।β-শীট ​​সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার উপাদানগুলি IZUMO1 এবং SPACA6 দ্বারা ভাগ করা হয়েছে, যদিও IZUMO1-এর চেইনগুলি অনেক বেশি লম্বা এবং 310 হেলিক্স (হেলিক্স 5) SPACA6 এর জন্য অনন্য।এই পার্থক্য দুটি অন্যথায় অনুরূপ প্রোটিনের জন্য ভিন্ন ডোমেন অভিযোজন ফলাফল.
আমাদের ডালি সার্ভার অনুসন্ধান প্রকাশ করেছে যে SPACA6 এবং IZUMO1 হল প্রোটিন ডাটাবেসে সংরক্ষিত শুধুমাত্র দুটি পরীক্ষামূলকভাবে নির্ধারিত কাঠামো যার এই বিশেষ 4HB ভাঁজ (টেবিল S1) রয়েছে৷অতি সম্প্রতি, DeepMind (Alphabet/Google) AlphaFold তৈরি করেছে, একটি নিউরাল নেটওয়ার্ক ভিত্তিক সিস্টেম যা প্রাথমিক অনুক্রম থেকে প্রোটিনের 3D কাঠামোর সঠিকভাবে পূর্বাভাস দিতে পারে।আমরা SPACA6 কাঠামোর সমাধান করার কিছুক্ষণ পরে, আলফাফোল্ড ডাটাবেস প্রকাশ করা হয়েছিল, যা মানুষের প্রোটিওম 48,49-এর সমস্ত প্রোটিনের 98.5% কভার করে ভবিষ্যদ্বাণীমূলক কাঠামোর মডেল সরবরাহ করে।আমাদের সমাধানকৃত SPACA6 কাঠামোকে একটি অনুসন্ধান মডেল হিসাবে ব্যবহার করে, আলফাফোল্ড মানব প্রোটিমে মডেলের জন্য একটি কাঠামোগত হোমোলজি অনুসন্ধান SPACA6 এবং IZUMO1 এর সাথে সম্ভাব্য কাঠামোগত মিল রয়েছে এমন প্রার্থীদের চিহ্নিত করেছে।SPACA6 (Fig. S10a)-এর পূর্বাভাস দেওয়ার ক্ষেত্রে AlphaFold-এর অবিশ্বাস্য নির্ভুলতার প্রেক্ষিতে—বিশেষ করে 1.1 Å rms ectodomain আমাদের সমাধান করা কাঠামোর (Fig. S10b)-এর তুলনায়—আমরা নিশ্চিত হতে পারি যে চিহ্নিত SPACA6 মিলগুলি সঠিক হতে পারে৷
পূর্বে, PSI-BLAST তিনটি শুক্রাণু-সম্পর্কিত প্রোটিনের সাথে IZUMO1 ক্লাস্টারের জন্য অনুসন্ধান করেছিল: IZUMO2, IZUMO3 এবং IZUMO450।আলফাফোল্ড ভবিষ্যদ্বাণী করেছে যে এই IZUMO ফ্যামিলি প্রোটিনগুলি 4HB ডোমেনে IZUMO1 (চিত্র 3a এবং S11) এর মতো একই ডিসালফাইড বন্ড প্যাটার্নের সাথে ভাঁজ করে, যদিও তাদের Ig-এর মতো ডোমেনের অভাব রয়েছে।এটা অনুমান করা হয় যে IZUMO2 এবং IZUMO3 হল IZUMO1 এর মতো একতরফা ঝিল্লি প্রোটিন, যখন IZUMO4 নিঃসৃত বলে মনে হয়।গেমেট ফিউশনে IZUMO 2, 3, এবং 4 প্রোটিনের কাজগুলি নির্ধারণ করা হয়নি।IZUMO3 শুক্রাণু বিকাশের সময় অ্যাক্রোসোম বায়োজেনেসিসে ভূমিকা পালন করতে পরিচিত 51 এবং IZUMO প্রোটিন একটি জটিল 50 গঠন করতে পাওয়া গেছে।স্তন্যপায়ী প্রাণী, সরীসৃপ এবং উভচর প্রাণীদের মধ্যে IZUMO প্রোটিনের সংরক্ষণ পরামর্শ দেয় যে তাদের সম্ভাব্য কার্যকারিতা অন্যান্য পরিচিত গেমেট-ফিউশন-সম্পর্কিত প্রোটিনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেমন DCST1/2, SOF1 এবং FIMP।
IST সুপারফ্যামিলির ডোমেন আর্কিটেকচারের ডায়াগ্রাম, যেখানে 4HB, কব্জা, এবং Ig-এর মতো ডোমেনগুলি যথাক্রমে কমলা, সবুজ এবং নীল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে।IZUMO4 এর একটি অনন্য সি-টার্মিনাল অঞ্চল রয়েছে যা দেখতে কালো।নিশ্চিত এবং পুটেটিভ ডিসালফাইড বন্ড যথাক্রমে কঠিন এবং বিন্দুযুক্ত রেখা দ্বারা দেখানো হয়।b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (আলফাফোল্ড DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (আলফাফোল্ড DB: AF-Q1ZYLF1), এবং AlphaFold-5 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) প্যানেলের মতো একই রঙের পরিসরে প্রদর্শিত হয়। ডিসালফাইড বন্ডগুলি ম্যাজেন্টায় দেখানো হয়।TMEM95, IZUMO2 এবং IZUMO3 ট্রান্সমেমব্রেন হেলিস দেখানো হয় না।
IZUMO প্রোটিনের বিপরীতে, অন্যান্য SPACA প্রোটিন (যেমন, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, এবং SPACA9) SPACA6 (চিত্র S12) থেকে গঠনগতভাবে আলাদা বলে মনে করা হয়।শুধুমাত্র SPACA9-এর 4HB আছে, কিন্তু এটিতে SPACA6-এর মতো একই সমান্তরাল-বিরোধী-সমান্তরাল অভিযোজন বা একই ডিসালফাইড বন্ধন থাকবে বলে আশা করা যায় না।শুধুমাত্র SPACA1 এর একটি অনুরূপ Ig-এর মতো ডোমেন রয়েছে।আলফাফোল্ড ভবিষ্যদ্বাণী করে যে SPACA3, SPACA4 এবং SPACA5 এর SPACA6 থেকে সম্পূর্ণ ভিন্ন কাঠামো রয়েছে।মজার বিষয় হল, SPACA4 নিষিক্তকরণে ভূমিকা পালন করার জন্যও পরিচিত, কিন্তু SPACA6 এর চেয়ে বেশি পরিমাণে, পরিবর্তে শুক্রাণু এবং oocyte zona pellucida52 এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়াকে সহজতর করে।
আমাদের AlphaFold অনুসন্ধান IZUMO1 এবং SPACA6 4HB, TMEM95-এর জন্য আরেকটি মিল খুঁজে পেয়েছে।TMEM95, একটি একক শুক্রাণু-নির্দিষ্ট ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন, পুরুষ ইঁদুরকে বন্ধ্যা করে দেয় যখন 32,33 হ্রাস পায়।TMEM95 শূন্য শুক্রাণুতে স্বাভাবিক রূপবিদ্যা, গতিশীলতা এবং জোনা পেলুসিডা ভেদ করে ডিমের ঝিল্লির সাথে আবদ্ধ হওয়ার ক্ষমতা ছিল, কিন্তু oocyte ঝিল্লির সাথে ফিউজ করতে পারেনি।পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখানো হয়েছে যে TMEM95 IZUMO133 এর সাথে কাঠামোগত মিল শেয়ার করে।প্রকৃতপক্ষে, আলফাফোল্ড মডেল নিশ্চিত করেছে যে TMEM95 হল একটি 4HB যার একই জোড়া CXXC মোটিফ IZUMO1 এবং SPACA6 এবং একই অতিরিক্ত ডিসালফাইড বন্ধন 1 এবং 2 এর মধ্যে SPACA6 (চিত্র 3a এবং S11) পাওয়া গেছে।যদিও TMEM95-এ একটি Ig-এর মতো ডোমেনের অভাব রয়েছে, তবে এটিতে SPACA6 এবং IZUMO1 কব্জা অঞ্চলের মতো একটি ডাইসলফাইড বন্ড প্যাটার্ন সহ একটি অঞ্চল রয়েছে (চিত্র 3b)।এই পাণ্ডুলিপি প্রকাশের সময়, প্রিপ্রিন্ট সার্ভার TMEM95 এর কাঠামোর রিপোর্ট করেছে, AlphaFold53 ফলাফল নিশ্চিত করেছে।TMEM95 SPACA6 এবং IZUMO1 এর সাথে খুব সাদৃশ্যপূর্ণ এবং বিবর্তনীয়ভাবে ইতিমধ্যেই উভচরদের মধ্যে সংরক্ষিত (চিত্র 4 এবং S13)।
PSI-BLAST অনুসন্ধান NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, এবং SOF1 ডাটাবেস ব্যবহার করে জীবনের গাছে এই ক্রমগুলির অবস্থান নির্ধারণ করতে।শাখা পয়েন্টের মধ্যে দূরত্ব স্কেল দেখানো হয় না।
SPACA6 এবং IZUMO1-এর মধ্যে উল্লেখযোগ্য সামগ্রিক কাঠামোগত মিল পরামর্শ দেয় যে তারা একটি সংরক্ষিত কাঠামোগত সুপারফ্যামিলির প্রতিষ্ঠাতা সদস্য যার মধ্যে TMEM95 এবং IZUMO 2, 3, এবং 4 প্রোটিন রয়েছে।পরিচিত সদস্য: IZUMO1, SPACA6 এবং TMEM95।যেহেতু মাত্র কয়েকজন সদস্যের কাছে Ig-এর মতো ডোমেন রয়েছে, তাই IST সুপারফ্যামিলির বৈশিষ্ট্য হল 4HB ডোমেন, যার অনন্য বৈশিষ্ট্য রয়েছে এই সমস্ত প্রোটিনের সাথে সাধারণ: 1) কুণ্ডলীকৃত 4HB একটি অ্যান্টি-সমান্তরাল/সমান্তরাল বিকল্পে সাজানো হেলিস সহ (চিত্র . 5a), 2) বান্ডেলটির একটি ত্রিভুজাকার মুখ রয়েছে যার মধ্যে দুটি হেলিক্স রয়েছে এবং একটি তৃতীয় উল্লম্ব হেলিক্স রয়েছে (চিত্র। কী এলাকা (চিত্র 5c)। CXXC মোটিফ, থিওরেডক্সিনের মতো প্রোটিনে পাওয়া যায়, এটি কাজ করতে পরিচিত। একটি রেডক্স সেন্সর হিসাবে 54,55,56 , যখন IST পরিবারের সদস্যদের মোটিফ প্রোটিন ডাইসালফাইড আইসোমেরেসের সাথে যুক্ত হতে পারে যেমন ERp57 গেমেট ফিউশনে। ভূমিকা 57,58 সম্পর্কিত।
IST সুপারফ্যামিলির সদস্যদের 4HB ডোমেনের তিনটি বৈশিষ্ট্য দ্বারা সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে: চারটি হেলিস সমান্তরাল এবং অ্যান্টিপ্যারালাল ওরিয়েন্টেশনের মধ্যে পর্যায়ক্রমে, ba-ত্রিভুজাকার হেলিকাল বান্ডেল ফেস এবং ছোট অণুর মধ্যে গঠিত একটি ca CXXC ডবল মোটিফ।) এন-টার্মিনাল হেলিক্স (কমলা) এবং কব্জা অঞ্চল β-হেয়ারপিন (সবুজ)।
SPACA6 এবং IZUMO1 এর মধ্যে মিল থাকায়, IZUMO1 বা JUNO-এর সাথে আবদ্ধ হওয়ার পূর্বের ক্ষমতা পরীক্ষা করা হয়েছিল।বায়োলেয়ার ইন্টারফেরোমেট্রি (BLI) হল একটি গতি-ভিত্তিক বাঁধাই পদ্ধতি যা পূর্বে IZUMO1 এবং জুনোর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া পরিমাপ করতে ব্যবহৃত হয়েছে।জুনো বিশ্লেষকের উচ্চ ঘনত্বের সাথে টোপ হিসাবে IZUMO1 এর সাথে বায়োটিন-লেবেলযুক্ত সেন্সরটি ইনকিউবেশন করার পরে, একটি শক্তিশালী সংকেত সনাক্ত করা হয়েছিল (চিত্র S14a), যা সেন্সর টিপের সাথে সংযুক্ত বায়োমেটেরিয়ালের বেধে একটি বাঁধাই-প্ররোচিত পরিবর্তন নির্দেশ করে।অনুরূপ সংকেত (অর্থাৎ, IZUMO1 বিশ্লেষকের বিরুদ্ধে একটি টোপ হিসাবে সেন্সরের সাথে সংযুক্ত JUNO) (চিত্র S14b)।SPACA6 যখন সেন্সর-বাউন্ড IZUMO1 বা সেন্সর-বাউন্ড জুনো (চিত্র S14a,b) এর বিরুদ্ধে বিশ্লেষক হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল তখন কোনও সংকেত সনাক্ত করা যায়নি।এই সংকেতের অনুপস্থিতি ইঙ্গিত দেয় যে SPACA6 এর বহির্মুখী ডোমেন IZUMO1 বা JUNO-এর বহির্কোষী ডোমেনের সাথে যোগাযোগ করে না।
যেহেতু বিএলআই অ্যাস টোপ প্রোটিনের বিনামূল্যে লাইসিন অবশিষ্টাংশের বায়োটিনিলেশনের উপর ভিত্তি করে, এই পরিবর্তনটি বাঁধাই প্রতিরোধ করতে পারে যদি লাইসিনের অবশিষ্টাংশগুলি মিথস্ক্রিয়ায় জড়িত থাকে।উপরন্তু, সেন্সরের সাপেক্ষে বাইন্ডিং এর ওরিয়েন্টেশন স্টেরিক প্রতিবন্ধকতা তৈরি করতে পারে, তাই রিকম্বিন্যান্ট SPACA6, IZUMO1 এবং JUNO ectodomains-এও প্রচলিত পুল-ডাউন অ্যাসেস করা হয়েছিল।তা সত্ত্বেও, SPACA6 হিস-ট্যাগযুক্ত IZUMO1 বা হিস-ট্যাগযুক্ত জুনো (চিত্র S14c,d) এর সাথে প্ররোচিত করেনি, যা BLI পরীক্ষায় পর্যবেক্ষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ কোনো মিথস্ক্রিয়া নির্দেশ করেনি।একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, আমরা তার IZUMO1 (চিত্র S14e এবং S15) লেবেলযুক্ত JUNO-এর মিথস্ক্রিয়া নিশ্চিত করেছি।
SPACA6 এবং IZUMO1 এর মধ্যে কাঠামোগত মিল থাকা সত্ত্বেও, SPACA6-এর অক্ষমতা জুনোকে আবদ্ধ করতে বিস্ময়কর নয়।মানুষের IZUMO1 এর পৃষ্ঠে 20 টিরও বেশি অবশিষ্টাংশ রয়েছে যা জুনোর সাথে যোগাযোগ করে, যার মধ্যে তিনটি অঞ্চলের প্রতিটি অবশিষ্টাংশ রয়েছে (যদিও তাদের বেশিরভাগই কব্জা অঞ্চলে অবস্থিত) (চিত্র S14f)।এই অবশিষ্টাংশগুলির মধ্যে, শুধুমাত্র একটি SPACA6 (Glu70) এ সংরক্ষিত।যদিও অনেক অবশিষ্টাংশ প্রতিস্থাপন তাদের মূল জৈব রাসায়নিক বৈশিষ্ট্য বজায় রেখেছিল, IZUMO1-তে প্রয়োজনীয় Arg160 অবশিষ্টাংশ SPACA6-তে ঋণাত্মক চার্জযুক্ত Asp148 দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়েছিল;পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে IZUMO1-এ Arg160Glu মিউটেশন JUNO43-এর সাথে আবদ্ধতাকে প্রায় সম্পূর্ণরূপে বিলুপ্ত করে।উপরন্তু, IZUMO1 এবং SPACA6 এর মধ্যে ডোমেন অভিযোজনের পার্থক্য উল্লেখযোগ্যভাবে SPACA6 (চিত্র S14g) এর সমতুল্য অঞ্চলের জুনো-বাইন্ডিং সাইটের পৃষ্ঠের ক্ষেত্রফলকে বৃদ্ধি করেছে।
গেমেট ফিউশনের জন্য SPACA6 এর পরিচিত প্রয়োজনীয়তা এবং IZUMO1 এর সাথে এর মিল থাকা সত্ত্বেও, SPACA6 এর সমতুল্য JUNO বাইন্ডিং ফাংশন আছে বলে মনে হয় না।অতএব, আমরা বিবর্তনীয় জীববিজ্ঞান দ্বারা প্রদত্ত গুরুত্বের প্রমাণের সাথে আমাদের কাঠামোগত ডেটা একত্রিত করার চেষ্টা করেছি।SPACA6 homologues এর সিকোয়েন্স অ্যালাইনমেন্ট স্তন্যপায়ী প্রাণীর বাইরে সাধারণ কাঠামোর সংরক্ষণ দেখায়।উদাহরণস্বরূপ, সিস্টাইনের অবশিষ্টাংশগুলি দূরবর্তীভাবে সম্পর্কিত উভচর প্রাণীর মধ্যেও উপস্থিত থাকে (চিত্র 6a)।ConSurf সার্ভার ব্যবহার করে, 66টি সিকোয়েন্সের একাধিক সিকোয়েন্স অ্যালাইনমেন্ট ধরে রাখার ডেটা SPACA6 পৃষ্ঠে ম্যাপ করা হয়েছে।এই ধরণের বিশ্লেষণ দেখাতে পারে যে প্রোটিন বিবর্তনের সময় কোন অবশিষ্টাংশগুলি সংরক্ষণ করা হয়েছে এবং কোন পৃষ্ঠের অঞ্চলগুলি কার্যে ভূমিকা পালন করে তা নির্দেশ করতে পারে।
CLUSTAL OMEGA ব্যবহার করে 12টি ভিন্ন প্রজাতির SPACA6 ectodomains-এর একটি সিকোয়েন্স অ্যালাইনমেন্ট।কনসার্ফ বিশ্লেষণ অনুসারে, সবচেয়ে রক্ষণশীল অবস্থানগুলি নীল রঙে চিহ্নিত করা হয়েছে।সিস্টাইনের অবশিষ্টাংশগুলি লাল রঙে হাইলাইট করা হয়।ডোমেনের সীমানা এবং গৌণ কাঠামোর উপাদানগুলি প্রান্তিককরণের শীর্ষে দেখানো হয়েছে, যেখানে তীরগুলি β-স্ট্র্যান্ডগুলি নির্দেশ করে এবং তরঙ্গগুলি হেলিসগুলি নির্দেশ করে৷এনসিবিআই অ্যাকসেস আইডেন্টিফায়ারগুলি যাতে সিকোয়েন্সগুলি রয়েছে: মানব (হোমো সেপিয়েন্স, NP_001303901), ম্যান্ড্রিল (ম্যান্ড্রিলাস লিউকোফেয়াস, XP_011821277), ক্যাপুচিন বানর (সেবুস মিমিক, XP_0173599, XP_01735936, caball, X2036, XP_01821277) তিমি (Orcinus orca3_23 XP_032_034)।), ভেড়া (ওভিস অ্যারিস, XP_014955560), হাতি (Loxodonta africana, XP_010585293), কুকুর (Canis lupus familyis, XP_025277208), মাউস (Mus musculus, NP_001155560), XP_001555638, ইঁদুর 611, XP_0318), প্লাটিপাস, 8) , 61_89 এবং Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113)।সংখ্যায়ন মানুষের ক্রম উপর ভিত্তি করে.b উপরের অংশে 4HB এবং নীচে Ig-এর মতো ডোমেন সহ SPACA6 কাঠামোর সারফেস উপস্থাপনা, ConSurf সার্ভার থেকে সংরক্ষণ অনুমানের উপর ভিত্তি করে রঙ।সর্বোত্তম সংরক্ষিত অংশগুলি নীল রঙে, মাঝারিভাবে সংরক্ষিত অংশগুলি সাদা এবং সবচেয়ে কম সংরক্ষিত অংশগুলি হলুদে।বেগুনি সিস্টাইন।তিনটি পৃষ্ঠের প্যাচ উচ্চ স্তরের সুরক্ষা প্রদর্শন করে ইনসেট লেবেলযুক্ত প্যাচ 1, 2 এবং 3 এ দেখানো হয়েছে। একটি 4HB কার্টুন উপরের ডানদিকে ইনসেটে দেখানো হয়েছে (একই রঙের স্কিম)।
SPACA6 কাঠামোতে তিনটি অত্যন্ত সংরক্ষিত পৃষ্ঠ অঞ্চল রয়েছে (চিত্র 6b)।প্যাচ 1 4HB এবং কব্জা অঞ্চলকে বিস্তৃত করে এবং এতে দুটি সংরক্ষিত CXXC ডিসালফাইড সেতু, একটি Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 কব্জা নেটওয়ার্ক (চিত্র S7), এবং তিনটি সংরক্ষিত বাইরের সুগন্ধি অবশিষ্টাংশ (Phe31, Tyr137, Phe31) রয়েছে।Ig-এর মতো ডোমেনের একটি বিস্তৃত রিম (চিত্র S6e), যা শুক্রাণুর পৃষ্ঠে বেশ কয়েকটি ইতিবাচক চার্জযুক্ত অবশিষ্টাংশের প্রতিনিধিত্ব করে।মজার বিষয় হল, এই প্যাচটিতে একটি অ্যান্টিবডি এপিটোপ রয়েছে যা পূর্বে SPACA6 30 ফাংশনে হস্তক্ষেপ করতে দেখানো হয়েছে।অঞ্চল 3 কবজা এবং Ig-এর মতো ডোমেনের একপাশে বিস্তৃত;এই অঞ্চলে সংরক্ষিত প্রোলাইন (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) এবং বহির্মুখী পোলার/চার্জড অবশিষ্টাংশ রয়েছে।আশ্চর্যজনকভাবে, 4HB-এর পৃষ্ঠের অধিকাংশ অবশিষ্টাংশ অত্যন্ত পরিবর্তনশীল (চিত্র 6b), যদিও ভাঁজটি SPACA6 হোমোলগ জুড়ে (হাইড্রোফোবিক বান্ডেল কোরের রক্ষণশীলতা দ্বারা নির্দেশিত) এবং IST সুপারফ্যামিলির বাইরেও সংরক্ষিত।
যদিও এটি SPACA6-এর সবচেয়ে ছোট অঞ্চল যেখানে সবচেয়ে কম শনাক্ত করা যায় এমন গৌণ কাঠামোর উপাদান রয়েছে, অনেক কব্জা অঞ্চলের অবশিষ্টাংশ (অঞ্চল 3 সহ) SPACA6 হোমোলগগুলির মধ্যে অত্যন্ত সংরক্ষিত রয়েছে, যা নির্দেশ করতে পারে যে হেলিকাল বান্ডেল এবং β-স্যান্ডউইচের অভিযোজন একটি ভূমিকা পালন করে।একটি রক্ষণশীল হিসাবে।যাইহোক, SPACA6 এবং IZUMO1 এর কব্জা অঞ্চলে ব্যাপক হাইড্রোজেন বন্ধন এবং ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক নেটওয়ার্ক থাকা সত্ত্বেও, IZUMO137,43,44-এর একাধিক অনুমোদিত কাঠামোর প্রান্তিককরণে অন্তর্নিহিত নমনীয়তার প্রমাণ দেখা যায়।পৃথক ডোমেনগুলির প্রান্তিককরণ ভালভাবে ওভারল্যাপ করা হয়েছে, কিন্তু ডোমেনগুলির একে অপরের সাথে সম্পর্কিত অভিযোজন কেন্দ্রীয় অক্ষ থেকে 50° থেকে 70° পর্যন্ত পরিবর্তিত হয়েছে (চিত্র S16)।সমাধানে SPACA6 এর গঠনগত গতিবিদ্যা বোঝার জন্য, SAXS পরীক্ষা করা হয়েছিল (চিত্র S17a,b)।SPACA6 ইক্টোডোমেনের প্রাথমিক পুনর্গঠন একটি রড স্ফটিক কাঠামোর (চিত্র S18) সাথে সঙ্গতিপূর্ণ, যদিও ক্র্যাটকি প্লট কিছুটা নমনীয়তা দেখায় (চিত্র S17b)।এই গঠনটি IZUMO1-এর সাথে বৈপরীত্য, যেখানে আনবাউন্ড প্রোটিনটি জালি এবং দ্রবণ উভয় ক্ষেত্রেই বুমেরাং আকার ধারণ করে।
বিশেষভাবে নমনীয় অঞ্চল সনাক্ত করার জন্য, হাইড্রোজেন-ডিউটেরিয়াম এক্সচেঞ্জ ভর স্পেকট্রোস্কোপি (H-DXMS) SPACA6 এ সম্পাদিত হয়েছিল এবং পূর্বে IZUMO143 (চিত্র 7a,b) এ প্রাপ্ত ডেটার সাথে তুলনা করা হয়েছিল।SPACA6 স্পষ্টতই IZUMO1 এর চেয়ে বেশি নমনীয়, যেমনটি 100,000 s বিনিময়ের পরে পুরো কাঠামো জুড়ে উচ্চতর ডিউটেরিয়াম বিনিময় দ্বারা প্রমাণিত।উভয় কাঠামোতেই, কব্জা অঞ্চলের সি-টার্মিনাল অংশটি একটি উচ্চ স্তরের বিনিময় দেখায়, যা সম্ভবত একে অপরের সাপেক্ষে 4HB এবং Ig-এর মতো ডোমেনের সীমিত ঘূর্ণনের অনুমতি দেয়।মজার বিষয় হল, 147CDLPLDCP154 অবশিষ্টাংশ সমন্বিত SPACA6 কব্জের C-টার্মিনাল অংশটি একটি অত্যন্ত সংরক্ষিত অঞ্চল 3 (চিত্র 6b), সম্ভবত ইঙ্গিত করে যে আন্তঃডোমেন নমনীয়তা SPACA6 এর একটি বিবর্তনীয়ভাবে সংরক্ষিত বৈশিষ্ট্য।নমনীয়তা বিশ্লেষণ অনুসারে, সিডি থার্মাল মেল্ট ডেটা দেখিয়েছে যে SPACA6 (Tm = 51.2°C) IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (চিত্র S1e এবং S19) থেকে কম স্থিতিশীল।
SPACA6 এবং b IZUMO1 এর একটি H-DXMS চিত্র।শতাংশ ডিউটেরিয়াম বিনিময় নির্দেশিত সময় পয়েন্টে নির্ধারিত হয়েছিল।হাইড্রোজেন-ডিউটেরিয়াম বিনিময়ের মাত্রাগুলি নীল (10%) থেকে লাল (90%) পর্যন্ত গ্রেডিয়েন্ট স্কেলে রঙ দ্বারা নির্দেশিত হয়।ব্ল্যাক বক্সগুলি উচ্চ বিনিময়ের ক্ষেত্রগুলিকে প্রতিনিধিত্ব করে।স্ফটিক কাঠামোতে পর্যবেক্ষণ করা 4HB, কব্জা এবং Ig-এর মতো ডোমেনের সীমানা প্রাথমিক অনুক্রমের উপরে দেখানো হয়েছে।10 s, 1000 s, এবং 100,000 s-এ ডিউটেরিয়াম এক্সচেঞ্জ লেভেলগুলি SPACA6 এবং IZUMO1 এর স্বচ্ছ আণবিক পৃষ্ঠের উপর চাপানো একটি স্ট্রিপ চার্টে প্লট করা হয়েছিল।50% এর নিচে ডিউটেরিয়াম বিনিময় স্তর সহ কাঠামোর অংশগুলি সাদা রঙের।50% H-DXMS এক্সচেঞ্জের উপরে অঞ্চলগুলি গ্রেডিয়েন্ট স্কেলে রঙিন হয়।
CRISPR/Cas9 এবং মাউস জিন নকআউট জেনেটিক কৌশলগুলির ব্যবহার শুক্রাণু এবং ডিম বাঁধাই এবং ফিউশনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ কয়েকটি কারণ চিহ্নিত করেছে।IZUMO1-JUNO এবং CD9 কাঠামোর সু-বৈশিষ্ট্যযুক্ত মিথস্ক্রিয়া ছাড়াও, গ্যামেট ফিউশনের সাথে যুক্ত বেশিরভাগ প্রোটিন কাঠামোগত এবং কার্যকরীভাবে রহস্যময় থাকে।SPACA6 এর জৈব-ভৌতিক এবং কাঠামোগত বৈশিষ্ট্য হল নিষিক্তকরণের সময় আনুগত্য/ফিউশন আণবিক ধাঁধার আরেকটি অংশ।
SPACA6 এবং IST সুপারফ্যামিলির অন্যান্য সদস্যরা স্তন্যপায়ী প্রাণীর পাশাপাশি পৃথক পাখি, সরীসৃপ এবং উভচর প্রাণীদের মধ্যে অত্যন্ত সংরক্ষিত বলে মনে হয়;প্রকৃতপক্ষে, এটি মনে করা হয় যে জেব্রাফিশ 59-এ নিষিক্তকরণের জন্য SPACA6 এর প্রয়োজন হয়। এই বিতরণটি অন্যান্য পরিচিত গ্যামেট ফিউশন-সম্পর্কিত প্রোটিন যেমন DCST134, DCST234, FIMP31, এবং SOF132-এর মতো, যা পরামর্শ দেয় যে এই কারণগুলি HAP2-এর ঘাটতি (এছাড়াও) GCS1) প্রোটিন যা অনেক প্রোটিস্টের অনুঘটক কার্যকলাপের জন্য দায়ী।, গাছপালা, এবং আর্থ্রোপড।নিষিক্ত ফিউশন প্রোটিন 60, 61. SPACA6 এবং IZUMO1 এর মধ্যে শক্তিশালী কাঠামোগত মিল থাকা সত্ত্বেও, এই প্রোটিনগুলির যেকোন একটিকে এনকোড করা জিনের নকআউটের ফলে পুরুষ ইঁদুরের মধ্যে বন্ধ্যাত্ব দেখা দেয়, যা ইঙ্গিত করে যে গেমেট ফিউশনে তাদের কাজগুলি নকল নয়৷.আরও বিস্তৃতভাবে, ফিউশনের আনুগত্য পর্যায়ের জন্য প্রয়োজনীয় জ্ঞাত শুক্রাণু প্রোটিনগুলির কোনওটিই অপ্রয়োজনীয় নয়।
এটি একটি উন্মুক্ত প্রশ্ন থেকে যায় যে SPACA6 (এবং IST সুপারফ্যামিলির অন্যান্য সদস্যরা) আন্তঃগ্যামেটিক জংশনে অংশগ্রহণ করে, ফিউশন পয়েন্টে গুরুত্বপূর্ণ প্রোটিন নিয়োগের জন্য ইন্ট্রাগ্যামেটিক নেটওয়ার্ক গঠন করে, অথবা সম্ভবত অধরা ফুসোজেন হিসাবে কাজ করে।HEK293T কোষে সহ-ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন স্টাডিজ পূর্ণ দৈর্ঘ্য IZUMO1 এবং SPACA632 এর মধ্যে একটি মিথস্ক্রিয়া প্রকাশ করেছে।যাইহোক, আমাদের রিকম্বিন্যান্ট ইক্টোডোমেনগুলি ভিট্রোতে ইন্টারঅ্যাক্ট করেনি, পরামর্শ দেয় যে নোডা এট আল-এ দেখা মিথস্ক্রিয়াগুলি।উভয়ই নির্মাণে মুছে ফেলা হয়েছিল (আইজিইউএমও১ এর সাইটোপ্লাজমিক লেজটি লক্ষ্য করুন, যা নিষিক্তকরণের জন্য অপ্রয়োজনীয় বলে দেখানো হয়েছে)।বিকল্পভাবে, IZUMO1 এবং/অথবা SPACA6-এর জন্য নির্দিষ্ট বাঁধাই পরিবেশের প্রয়োজন হতে পারে যা আমরা ভিট্রোতে পুনরুত্পাদন করি না, যেমন শারীরবৃত্তীয়ভাবে নির্দিষ্ট কনফর্মেশন বা আণবিক কমপ্লেক্স যাতে অন্যান্য প্রোটিন থাকে (জানা বা এখনও আবিষ্কৃত হয়নি)।যদিও IZUMO1 ইক্টোডোমেন পেরিভিটেলাইন স্পেসে ডিম্বাণুর সাথে স্পার্মাটোজোয়া সংযুক্ত করার মধ্যস্থতা করে বলে বিশ্বাস করা হয়, তবে SPACA6 ইক্টোডোমেনের উদ্দেশ্য অস্পষ্ট।
SPACA6 এর গঠন প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়ায় জড়িত হতে পারে এমন বেশ কয়েকটি সংরক্ষিত পৃষ্ঠকে প্রকাশ করে।কব্জা অঞ্চলের সংরক্ষিত অংশটি অবিলম্বে CXXC মোটিফের (উপরে মনোনীত প্যাচ 1) সংলগ্ন বেশ কয়েকটি বাহ্যিক-মুখী সুগন্ধযুক্ত অবশিষ্টাংশ রয়েছে যা প্রায়শই জৈব অণুগুলির মধ্যে হাইড্রোফোবিক এবং π-স্ট্যাকিং মিথস্ক্রিয়াগুলির সাথে যুক্ত থাকে।Ig-এর মতো ডোমেনের (অঞ্চল 2) বিস্তৃত দিকগুলি অত্যন্ত সংরক্ষিত Arg এবং তার অবশিষ্টাংশের সাথে একটি ইতিবাচক চার্জযুক্ত খাঁজ তৈরি করে এবং এই অঞ্চলের বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডিগুলি আগে গেমেট ফিউশন 30 ব্লক করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।অ্যান্টিবডি রৈখিক এপিটোপ 212RIRPAQLTHRGTFS225 চিনতে পারে, যার ছয়টি আর্জিনাইন অবশিষ্টাংশের মধ্যে তিনটি রয়েছে এবং হিস220 অত্যন্ত সংরক্ষিত।এই নির্দিষ্ট অবশিষ্টাংশ বা সমগ্র অঞ্চলের অবরোধের কারণে কর্মহীনতা হয়েছে কিনা তা স্পষ্ট নয়।β-স্যান্ডউইচের সি-টার্মিনাসের কাছে এই ফাঁকের অবস্থান প্রতিবেশী শুক্রাণু প্রোটিনের সাথে cis-মিথস্ক্রিয়া নির্দেশ করে, কিন্তু oocyte প্রোটিনের সাথে নয়।তদ্ব্যতীত, কবজের মধ্যে একটি অত্যন্ত নমনীয় প্রোলিন-সমৃদ্ধ জট (সাইট 3) ধারণ করা একটি প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়ার সাইট হতে পারে বা সম্ভবত, দুটি ডোমেনের মধ্যে নমনীয়তা বজায় রাখার ইঙ্গিত দেয়।SPACA6 এর অজানা ভূমিকার জন্য লিঙ্গ গুরুত্বপূর্ণ।গেমেটের সংমিশ্রণ।
SPACA6-এ আন্তঃকোষীয় আঠালো প্রোটিনের বৈশিষ্ট্য রয়েছে, যার মধ্যে Ig-এর মতো β-স্যান্ডউইচ রয়েছে।অনেক আঠালো প্রোটিন (যেমন, ক্যাডারিন, ইন্টিগ্রিনস, অ্যাডেসিন এবং IZUMO1) এক বা একাধিক β-স্যান্ডউইচ ডোমেন ধারণ করে যা কোষের ঝিল্লি থেকে প্রোটিনকে তাদের পরিবেশগত লক্ষ্যবস্তুতে প্রসারিত করে।SPACA6-এর Ig-এর মতো ডোমেনে একটি মোটিফও রয়েছে যা সাধারণত β-স্যান্ডউইচের আনুগত্য এবং সংহতির মধ্যে পাওয়া যায়: β-স্যান্ডউইচের প্রান্তে সমান্তরাল স্ট্র্যান্ডের দ্বিগুণ, যা যান্ত্রিক ক্ল্যাম্পস66 নামে পরিচিত।এটা বিশ্বাস করা হয় যে এই মোটিফ শিয়ার ফোর্সের প্রতিরোধ বাড়ায়, যা আন্তঃকোষীয় মিথস্ক্রিয়ায় জড়িত প্রোটিনের জন্য মূল্যবান।যাইহোক, অ্যাডেসিনের সাথে এই মিল থাকা সত্ত্বেও, বর্তমানে এমন কোন প্রমাণ নেই যে SPACA6 ডিমের সাদা অংশের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে।SPACA6 ectodomain JUNO-এর সাথে আবদ্ধ হতে অক্ষম, এবং SPACA6-প্রকাশকারী HEK293T কোষগুলি, যেমন এখানে দেখানো হয়েছে, জোনা 32-এর অভাব নেই এমন oocytesগুলির সাথে খুব কমই যোগাযোগ করে।যদি SPACA6 আন্তঃগ্যামেটিক বন্ধন স্থাপন করে, এই মিথস্ক্রিয়াগুলির জন্য অনুবাদ-পরবর্তী পরিবর্তনের প্রয়োজন হতে পারে বা অন্যান্য শুক্রাণু প্রোটিন দ্বারা স্থিতিশীল হতে পারে।পরবর্তী অনুমানের সমর্থনে, IZUMO1-এর ঘাটতিযুক্ত শুক্রাণু oocytes-এর সাথে আবদ্ধ হয়, এটি প্রমাণ করে যে IZUMO1 ব্যতীত অন্য অণুগুলি গেমেট আনুগত্যের ধাপ 27-এর সাথে জড়িত।
অনেক ভাইরাল, সেলুলার এবং ডেভেলপমেন্টাল ফিউশন প্রোটিনের এমন বৈশিষ্ট্য রয়েছে যা ফুসোজেন হিসাবে তাদের কার্যের পূর্বাভাস দেয়।উদাহরণস্বরূপ, ভাইরাল ফিউশন গ্লাইকোপ্রোটিন (শ্রেণী I, II এবং III) প্রোটিনের শেষে একটি হাইড্রোফোবিক ফিউশন পেপটাইড বা লুপ থাকে যা হোস্ট মেমব্রেনে ঢোকানো হয়।IZUMO143-এর হাইড্রোফিলিসিটি মানচিত্র এবং IST-এর গঠন (নির্ধারিত এবং ভবিষ্যদ্বাণী করা) সুপারফ্যামিলি কোনো আপাত হাইড্রোফোবিক ফিউশন পেপটাইড দেখায়নি।এইভাবে, যদি IST-এর কোনো প্রোটিন সুপারফ্যামিলিভাবে ফুসোজেন হিসেবে কাজ করে, তাহলে তারা অন্য পরিচিত উদাহরণ থেকে ভিন্নভাবে তা করে।
উপসংহারে, গ্যামেট ফিউশনের সাথে যুক্ত প্রোটিনের আইএসটি সুপারফ্যামিলি সদস্যদের কার্যাবলী একটি উদ্বেগজনক রহস্য থেকে যায়।আমাদের বৈশিষ্ট্যযুক্ত SPACA6 রিকম্বিন্যান্ট অণু এবং এর সমাধান করা কাঠামো এই ভাগ করা কাঠামোর মধ্যে সম্পর্ক এবং গেমেট সংযুক্তি এবং ফিউশনে তাদের ভূমিকার অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করবে।
ভবিষ্যদ্বাণীকৃত মানব SPACA6 ইক্টোডোমেন (NCBI অ্যাক্সিশন নম্বর NP_001303901.1; অবশিষ্টাংশ 27-246) এর সাথে সম্পর্কিত ডিএনএ সিকোয়েন্স ড্রোসোফিলা মেলানোগাস্টার S2 কোষে প্রকাশের জন্য কোডন-অপ্টিমাইজ করা হয়েছিল এবং জিন থেকোকোসনোজেন্সের সাথে একটি জিন কোকোসনোজেন্স ফ্র্যাগমেন্ট হিসাবে সংশ্লেষিত হয়েছিল।, BiP নিঃসরণ সংকেত এবং সংশ্লিষ্ট 5′ এবং 3′ এই জিনের বন্ধন-স্বাধীন ক্লোনিংয়ের জন্য একটি পিএমটি এক্সপ্রেশন ভেক্টরে পরিণত হয় যা একটি মেটালোথিওনিন প্রোমোটারের উপর ভিত্তি করে যা পিউরোমাইসিন (পিএমটি-পুরো) দিয়ে নির্বাচনের জন্য পরিবর্তিত হয়।পিএমটি-পুরো ভেক্টর একটি থ্রোম্বিন ক্লিভেজ সাইটকে এনকোড করে তার পরে একটি 10x-হিস সি-টার্মিনাল ট্যাগ (চিত্র S2)।
D. মেলানোগাস্টার S2 (Gibco) কোষে SPACA6 pMT-পুরো ভেক্টরের স্থিতিশীল স্থানান্তর IZUMO1 এবং JUNO43-এর জন্য ব্যবহৃত প্রোটোকলের অনুরূপভাবে সঞ্চালিত হয়েছিল।S2 কোষগুলি গলিয়ে স্নাইডারের মাধ্যমে (Gibco) 10% (v/v) তাপ-নিষ্ক্রিয় ভ্রূণ বাছুরের সিরাম (Gibco) এবং 1X অ্যান্টিমাইকোটিক অ্যান্টিবায়োটিক (Gibco) এর চূড়ান্ত ঘনত্বের সাথে পরিপূরক করা হয়েছিল।প্রারম্ভিক উত্তরণ কোষ (3.0 x 106 কোষ) 6-ওয়েল প্লেটের (কর্নিং) পৃথক কূপে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল।27 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 24 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পর, প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে কোষগুলি SPACA6 pMT-পুরো ভেক্টর এবং ইফেক্টিন ট্রান্সফেকশন রিএজেন্ট (কিয়াজেন) এর 2 মিলিগ্রাম মিশ্রণের সাথে স্থানান্তরিত হয়েছিল।স্থানান্তরিত কোষগুলি 72 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল এবং তারপরে 6 মিলিগ্রাম/মিলি পিউরোমাইসিন দিয়ে কাটা হয়েছিল।কোষগুলিকে তখন সম্পূর্ণ স্নাইডারের মাধ্যম থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয় এবং বৃহৎ আকারের প্রোটিন উৎপাদনের জন্য সিরাম মুক্ত ইনসেক্ট-এক্সপ্রেস মিডিয়ামে (লোনজা) স্থাপন করা হয়।S2 সেল কালচারের একটি 1 L ব্যাচ 8-10 × 106 ml-1 কোষে 2 L বায়ুচলাচলযুক্ত ফ্ল্যাট-বটমড পলিপ্রোপিলিন Erlenmeyer ফ্লাস্কে বৃদ্ধি করা হয়েছিল এবং তারপর 500 µM CuSO4 (মিলিপুর সিগমা) এবং জীবাণুমুক্ত ফিল্টার এর চূড়ান্ত ঘনত্ব দিয়ে জীবাণুমুক্ত করা হয়েছিল।প্ররোচিতপ্ররোচিত সংস্কৃতিগুলি চার দিনের জন্য 120 rpm-এ 27° সেন্টিগ্রেডে ইনকিউবেট করা হয়েছিল।
SPACA6 সম্বলিত কন্ডিশনড মিডিয়ামকে 5660×g 4°C তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং তারপরে একটি 10 ​​kDa MWCO ঝিল্লি সহ একটি সেন্ট্রামেট ট্যানজেনশিয়াল ফ্লো ফিল্টারেশন সিস্টেম (প্যাল ​​কর্প)।একটি 2 মিলি নি-এনটিএ অ্যাগারোজ রজন (কিয়াজেন) কলামে SPACA6 ধারণকারী ঘনীভূত মাধ্যম প্রয়োগ করুন।Ni-NTA রজন বাফার A-এর 10 টি কলাম ভলিউম (CV) দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপর 50 mM চূড়ান্ত ইমিডাজল ঘনত্ব দিতে বাফার A-এর 1 CV যোগ করা হয়েছিল।SPACA6 কে 10 মিলি বাফার A এর সাথে ইমিডাজল এর সাথে সম্পূরক 500 মিলিমিটারের চূড়ান্ত ঘনত্বে নির্গত করা হয়েছিল।ডায়ালাইসিস টিউবিং (MWCO 12-14 kDa) তে সীমাবদ্ধতা ক্লাস থ্রম্বিন (MWCO 12-14 kDa) সরাসরি যোগ করা হয়েছিল 1 ইউনিট প্রতি mg SPACA6 বনাম 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 এবং 150 mM NaCl (বাফার বি) ডায়ালাইসিসের জন্য।) ৪৮ ঘন্টার জন্য ৪°সে.থ্রোম্বিন-ক্লিভড SPACA6 তারপর লবণের ঘনত্ব কমাতে তিনগুণ পাতলা করা হয়েছিল এবং 10 মিলিমিটার ট্রিস-এইচসিএল, পিএইচ 7.5 এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ 1 মিলি মনোএস 5/50 জিএল ক্যাটেশন এক্সচেঞ্জ কলামে (সাইটিভা/জিই) লোড করা হয়েছিল।ক্যাটেশন এক্সচেঞ্জারটি 10 ​​মিমি ট্রিস-এইচসিএল, পিএইচ 7.5 এর 3 সিভি দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, তারপর 25 সিভির জন্য 10 মিমি ট্রিস-এইচসিএল, পিএইচ 7.5-তে 0 থেকে 500 মিমি NaCl এর রৈখিক গ্রেডিয়েন্টের সাথে SPACA6 এলুট করা হয়েছিল।আয়ন বিনিময় ক্রোমাটোগ্রাফির পরে, SPACA6 কে 1 মিলি কেন্দ্রীভূত করা হয়েছিল এবং একটি ENrich SEC650 10 x 300 কলাম (BioRad) থেকে বাফার বি এর সাথে সঙ্গতিপূর্ণ করা হয়েছে। ক্রোমাটোগ্রাম অনুসারে, SPACA6 ধারণকারী পুল এবং ঘনীভূত ভগ্নাংশ।বিশুদ্ধতা একটি 16% এসডিএস-পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলে কুমাসি-দাগযুক্ত ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল।বিয়ার-ল্যামবার্ট আইন এবং তাত্ত্বিক মোলার বিলুপ্তি সহগ ব্যবহার করে 280 এনএম-এ শোষণের মাধ্যমে প্রোটিনের ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল।
বিশুদ্ধ SPACA6 রাতারাতি 10 মিমি সোডিয়াম ফসফেট, pH 7.4 এবং 150 মিলিমিটার NaF এর বিপরীতে ডায়ালাইজ করা হয়েছিল এবং CD স্পেকট্রোস্কোপি দ্বারা বিশ্লেষণের আগে 0.16 mg/mL এ পাতলা করা হয়েছিল।185 থেকে 260 এনএম তরঙ্গদৈর্ঘ্য সহ সিডিগুলির বর্ণালী স্ক্যানিং 50 nm/মিনিট হারে 25°C এ 1 মিমি অপটিক্যাল পাথ দৈর্ঘ্য (হেলমা) সহ কোয়ার্টজ কিউভেট ব্যবহার করে একটি Jasco J-1500 স্পেকট্রোপোলারিমিটারে সংগ্রহ করা হয়েছিল।CD স্পেকট্রা বেসলাইন সংশোধন করা হয়েছে, গড় 10 টিরও বেশি অধিগ্রহণ করা হয়েছে, এবং cm2/dmol ডিগ্রীতে গড় অবশিষ্ট উপবৃত্তাকার (θMRE) রূপান্তরিত হয়েছে:
যেখানে MW হল Da-তে প্রতিটি নমুনার আণবিক ওজন;এন হল অ্যামিনো অ্যাসিডের সংখ্যা;θ হল মিলিডিগ্রীতে উপবৃত্তাকার;d সেমিতে অপটিক্যাল পাথের দৈর্ঘ্যের সাথে মিলে যায়;ইউনিটগুলিতে প্রোটিনের ঘনত্ব।