310 10*1mm স্টেইনলেস স্টীল কয়েলড টিউবিং রাসায়নিক উপাদান, স্পাইড্রয়েনের এন-টার্মিনাল ডোমেনগুলি অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিলের উপর ভিত্তি করে হাইড্রোজেল তৈরি করে এবং প্রোটিন স্থিরকরণের জন্য একটি প্ল্যাটফর্ম প্রদান করে।

Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি সীমিত CSS সমর্থন সহ একটি ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করছেন।সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷উপরন্তু, চলমান সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়া সাইট দেখাই।
স্লাইডার প্রতি স্লাইডে তিনটি নিবন্ধ দেখাচ্ছে৷স্লাইডগুলির মধ্য দিয়ে যেতে পিছনে এবং পরবর্তী বোতামগুলি ব্যবহার করুন, অথবা প্রতিটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যাওয়ার জন্য শেষে স্লাইড কন্ট্রোলার বোতামগুলি ব্যবহার করুন৷

স্পেসিফিকেশন

310 10*1mm স্টেইনলেস স্টীল কয়েলড টিউবিং সরবরাহকারী

রাসায়নিক রচনা

যান্ত্রিক বৈশিষ্ট্য

রিকম্বিন্যান্ট স্পাইডার সিল্ক প্রোটিন (স্পাইডার সিল্ক প্রোটিন) নতুন জৈব উপাদানের বিকাশে অনেক সম্ভাব্য প্রয়োগ রয়েছে, কিন্তু তাদের মাল্টিমোডাল এবং একত্রীকরণ-প্রবণ প্রকৃতি তাদের প্রাপ্ত করা কঠিন এবং ব্যবহার করা সহজ করে তোলে।এখানে আমরা রিপোর্ট করছি যে রিকম্বিন্যান্ট মিনিয়েচার স্পাইড্রয়েন প্রোটিন এবং গুরুত্বপূর্ণভাবে, এন-টার্মিনাল ডোমেন (এনটি) নিজেই দ্রুত 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে স্ব-সহায়ক এবং স্বচ্ছ হাইড্রোজেল তৈরি করে।NT এবং সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন বা পিউরিন নিউক্লিওসাইড ফসফরিলেজ সমন্বিত ফিউশন প্রোটিন সম্পূর্ণরূপে কার্যকরী ফিউশন প্রোটিন গঠন করে।হাইড্রোজেল।আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে রিকম্বিন্যান্ট এনটি এবং ফিউশন প্রোটিনগুলি উচ্চ অভিব্যক্তি ফলন প্রদান করে এবং হাইড্রোজেলগুলিকে আকর্ষণীয় বৈশিষ্ট্য যেমন স্বচ্ছতা, ক্রসলিংকিং ছাড়াই জেলেশন এবং উচ্চ ঘনত্বে সক্রিয় প্রোটিনগুলির সরাসরি স্থিরতা প্রদান করে।
মাকড়সার সাতটি বিভিন্ন সেট রেশম গ্রন্থি থাকে, প্রতিটি নির্দিষ্ট ধরণের রেশম তৈরি করে।সমস্ত সাতটি রেশম প্রজাতিই স্পাইডার সিল্ক প্রোটিন (স্পিড্রোইন) দ্বারা গঠিত প্রায় 6000 অবশিষ্টাংশ দীর্ঘ এবং একটি বৃহৎ কেন্দ্রীয় পুনরাবৃত্তি অঞ্চল ধারণ করে যা গোলাকার N- এবং C-টার্মিনাল ডোমেইন (NT এবং CT) 1,2 দ্বারা বেষ্টিত।রেশমের সবচেয়ে ব্যাপকভাবে অধ্যয়ন করা হয়, প্রাথমিক অ্যাম্পুলা, প্রাথমিক অ্যাম্পুলা গ্রন্থি দ্বারা উত্পাদিত হয়।এই গ্রন্থিতে, এপিথেলিয়াল কোষের একটি মনোলেয়ার স্পাইড্রোইন প্রোটিন সংশ্লেষিত করে এবং সেগুলিকে গ্রন্থির লুমেনে নিঃসৃত করে, যেখানে তারা অত্যন্ত উচ্চ ঘনত্বে (30-50% w/v)3,4 দ্রবণীয় আকারে (ডোপিং) উপস্থিত থাকে।গ্রন্থিতে প্রধান অ্যাম্পুলার স্পাইড্রয়েন প্রোটিনগুলির সংগঠন এবং গঠন নিয়ে বিতর্ক হয়েছে, তবে বেশিরভাগ পরীক্ষামূলক প্রমাণগুলি সাধারণত হেলিকাল এবং/অথবা এলোমেলো হেলিকাল কনফর্মেশন এবং মাইকেলার বা ল্যামেলার গঠন 5,6,7,8,9,10 এর উপস্থিতি নির্দেশ করে।যদিও পুনরাবৃত্ত ডোমেনগুলি রেশম তন্তুগুলির যান্ত্রিক বৈশিষ্ট্যগুলিকে নিয়ন্ত্রণ করে, β-শীট ​​ন্যানোক্রিস্টাল এবং নিরাকার কাঠামো গঠন করে 11,12,13,14,15, শেষ ডোমেনগুলি রেশম গ্রন্থি 16,17,18 বরাবর পরিবর্তিত অবস্থার প্রতিক্রিয়া হিসাবে রেশম তন্তুগুলিকে নিয়ন্ত্রণ করে৷রেশম গঠন নিয়ন্ত্রণ করে, 19. টার্মিনাল ডোমেনগুলি বিবর্তনীয়ভাবে সংরক্ষিত হয় এবং তাদের কার্যকারিতা সমস্ত স্পাইড্রয়েন প্রোটিন 2,20,21 এর জন্য সাধারণ হতে পারে।গ্রন্থির মধ্য দিয়ে যাওয়ার সময়, স্পাইড্রয়েনের pH প্রায় 7.6 থেকে <5.716 পর্যন্ত হ্রাস পায় এবং ধীরে ধীরে সংকীর্ণ নালীর মধ্য দিয়ে চলাচলের মাধ্যমে শিয়ার এবং প্রসারিত মধ্যস্থতায় বৃদ্ধি পায়।সমাধানে, CT হল একটি α-হেলিকাল গঠনমূলক সমান্তরাল ডাইমার17, কিন্তু কম pH এবং শিয়ার ফোর্সের প্রতিক্রিয়ায়, CT β-স্তর 16, 17 কে উন্মোচন করে এবং পরিবর্তন করে, সম্ভবত রূপান্তর 16-এর পুনরাবৃত্তিমূলক অঞ্চলে β-স্তরগুলিকে ট্রিগার করে। গ্রন্থির লুমেনে অবস্থার প্রতিফলন ঘটায় এবং স্পাইড্রয়েনের দ্রবণীয়তাকে মধ্যস্থতা করে, কিন্তু পিএইচ কম হলে, কার্বোক্সিলিক অ্যাসিড সাইড চেইনের প্রোটোনেশন প্রায় 6.5 এর pKa সহ এনটির ডাইমারাইজেশনের দিকে পরিচালিত করে, যার ফলে এনটি স্থিতিশীল হয় এবং বড় আকারে স্পাইড্রয়েন ঠিক করে। পরিমাণনেটওয়ার্ক 16,18।এইভাবে, NT ফিলামেন্ট গঠনে একটি মুখ্য ভূমিকা পালন করে, আবরণের একটি মনোমার থেকে ফাইবার 23,24,25-এ একটি ডাইমারে পরিবর্তিত হয়।16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 তারিখ পর্যন্ত অধ্যয়ন করা সমস্ত অবস্থার অধীনে NT অত্যন্ত দ্রবণীয় এবং হেলিকাল রয়ে গেছে, যা হেটেরোলজাস প্রোটিন উত্পাদনের জন্য দ্রবণীয়তা-বর্ধক লেবেল হিসাবে এর বিকাশকে অনুপ্রাণিত করেছে।
রিকম্বিন্যান্ট মিনি স্পাইডার সিল্ক প্রোটিন, একটি NT, একটি সংক্ষিপ্ত পুনরাবৃত্তি অঞ্চল, একটি CT, এবং পরিশোধনের জন্য একটি His6 ট্যাগ (His-NT2RepCT) সমন্বিত, জলীয় বাফারে নেটিভ স্পাইডার সিল্ক প্রোটিনের মতো দ্রবণীয় এবং রেশম মাকড়সার স্থানীয় গুরুত্বপূর্ণ বৈশিষ্ট্যগুলিকে অনুকরণ করে। .কভারেজ 25.31।His-NT2RepCT একটি বায়োমিমেটিক মেশিন ব্যবহার করে অবিচ্ছিন্ন ফাইবারে কাটা যেতে পারে যেখানে একটি pH 8 দ্রবণীয় আবরণ একটি pH 525,32,33,34,35 জলের স্নানে বের করা হয়।E. coli-এর বায়োরিয়্যাক্টর গাঁজন তার-NT2RepCT প্রকাশ করে এবং পরবর্তী চিকিত্সার ফলে শোধনের পরে> 14 g/L ফলন পাওয়া যায়।উচ্চ ফলন, উচ্চ দ্রবণীয়তা এবং অম্লীয় পরিস্থিতিতে His-NT2RepCT-এর পর্যাপ্ত প্রতিক্রিয়া সবই NT23, 25, 34-এর জন্য দায়ী।
এখানে আমরা 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে একটি প্রোটিন দ্রবণ ইনকিউবেশন করে একা এনটি সহ রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন প্রোটিন থেকে স্বচ্ছ হাইড্রোজেলগুলির দ্রুত গঠনের প্রতিবেদন করি।থিওফ্লাভিন টি ফ্লুরোসেন্স (ThT), ফুরিয়ার ট্রান্সফর্ম ইনফ্রারেড স্পেকট্রোস্কোপি (FTIR), নিউক্লিয়ার ম্যাগনেটিক রেজোন্যান্স স্পেকট্রোস্কোপি (NMR) এবং ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) ব্যবহার করে, আমরা দেখতে পেলাম যে NT এবং মাইক্রোস্পাইডার প্রোটিনগুলি β-শীট ​​এবং অ্যামাইলয়েড-সদৃশ ফাইবারে কাঠামোগত রূপান্তর করে। যখন জেল তৈরি হয়।উপরন্তু, NT এবং সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) বা পিউরিন নিউক্লিওসাইড ফসফোরাইলেজ (PNP) এর ফিউশন প্রোটিন সম্পূর্ণরূপে কার্যকরী ফিউশন টুকরো দিয়ে হাইড্রোজেল গঠন করে।শারীরবৃত্তীয় অবস্থার অধীনে হাইড্রোজেলগুলির দ্রুত গঠনের সাথে মিলিত হেটেরোলগাস হোস্টগুলিতে উচ্চ-থ্রুপুট এক্সপ্রেশন, ইঞ্জিনিয়ারড ফাংশন সহ হাইড্রোজেলগুলির সাশ্রয়ী উত্পাদনের সম্ভাবনা উন্মুক্ত করে।
বেশিরভাগ রিপোর্ট করা রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন প্রোটিনের বিপরীতে, His-NT2RepCT Tris-HCl বাফারে pH 8 এ স্থিতিশীল এবং বৃষ্টিপাত ছাড়াই 500 mg/mL পর্যন্ত ঘনীভূত হতে পারে।অতএব, আমরা আশ্চর্য হয়েছি যে এই প্রোটিনটি দ্রুত অপটিক্যালি পরিষ্কার, স্ব-সমর্থক হাইড্রোজেল গঠন করে যখন 37°C (চিত্র 1b-d) তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়।আরও গবেষণায় দেখা গেছে যে His-NT2RepCT জেলেশন বিস্তৃত প্রোটিন ঘনত্বের (10-300 mg/mL) উপর ঘটেছে এবং এই ঘনত্বটি জেলেশন সময়ের সাথে বিপরীতভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (চিত্র 1c এবং পরিপূরক চিত্র 1)।His-NT2RepCT-এর কোন অংশগুলি হাইড্রোজেল গঠনের মধ্যস্থতা করে তা খুঁজে বের করার জন্য, আমরা তারপরে প্রতিটি ডোমেন পৃথকভাবে এবং বিভিন্ন সংমিশ্রণে একটি ফ্লাস্ক ইনভার্সন অ্যাস ব্যবহার করে পরীক্ষা করেছি (চিত্র 1a, b)।রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েনের সমস্ত পরীক্ষিত ভগ্নাংশ 1 ঘন্টারও কম সময়ে জেল তৈরি করে (300 mg/mL প্রোটিন ঘনত্বে), প্রিপিপিটেটেড 2Rep (চিত্র 1b) ব্যতীত।এটি পরামর্শ দেয় যে NT এবং CT একা, সংমিশ্রণে, বা পুনরাবৃত্তির সাথে যুক্ত, 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে জেল করতে পারে এবং His6 ট্যাগ এই প্রক্রিয়াটিকে কোনও উল্লেখযোগ্য পরিমাণে প্রভাবিত করে না।সাধারণ ধারণার প্রেক্ষিতে যে এনটি একটি অত্যন্ত দ্রবণীয় এবং স্থিতিশীল প্রোটিন, এবং রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন হাইড্রোজেলের পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলি পুনরাবৃত্ত অঞ্চল এবং/অথবা সিটিতে গঠনগত পরিবর্তনের জন্য জেলেশন প্রভাবকে দায়ী করেছে, এনটি নিজেই পারে।জেলেশন আবিষ্কার অপ্রত্যাশিত ছিল।পরিপূরক সারণী 1) 37, 38, 39. লক্ষণীয়ভাবে, NT ইতিমধ্যে 10 মিনিটের মধ্যে ≥ 300 mg/mL (চিত্র 1c) এর ঘনত্বে জেল হয়ে গেছে।NT এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে শিশির বিপরীত পরীক্ষাগুলি দেখায় যে 50 mg/mL তে NT দ্রবণটি সংশ্লিষ্ট ঘনত্বে His-NT2RepCT-এর চেয়ে দ্রুততর হয় (w/v, চিত্র 1c)।
এই কাজে অধ্যয়ন করা বিভিন্ন স্পাইড্রয়েন নির্মাণের পরিকল্পিত উপস্থাপনা।b বিভিন্ন রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন প্রোটিনের (300 mg/mL) জন্য 37 °C তাপমাত্রায় জেলের সময় শিশিটি উল্টে দিয়ে যাচাই করা হয়।ইনকিউবেশন ছাড়াই অবিলম্বে সিটি জেল (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm স্কেল)।হিস-NT2RepCT এবং NT এর জেল সময় 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে নির্দেশিত প্রোটিন ঘনত্বে।d মাকড়সা সহ His-NT2RepCT এবং NT হাইড্রোজেলের ফটোগ্রাফ এবং নীচে প্রিন্ট করা অক্ষর "NT" যথাক্রমে (উভয় 200 mg/mL, স্কেল বার 5 mm)।
বিভিন্ন রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন প্রোটিন দ্বারা গঠিত হাইড্রোজেলের রং কিছুটা আলাদা, এবং খালি চোখে পর্যবেক্ষণ করলে স্বচ্ছতার বিভিন্ন মাত্রা দেখা যায় (চিত্র 1b)।এনটি জেলগুলি ব্যতিক্রমীভাবে পরিষ্কার যখন অন্যান্য জেলগুলি অস্বচ্ছ হয়ে যায়।তার-NT2RepCT এবং NT জেলগুলি নলাকার টিউবে নিক্ষেপ করা ছাঁচ থেকে অক্ষত (চিত্র 1d) সরানো যেতে পারে।
প্রাকৃতিক মাকড়সার রেশম আবরণ জেল এখন রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন প্রোটিনের জেলেশন ঘটায় কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, সুইডিশ ব্রিজ স্পাইডার (ল্যারিনিওডিস স্কলোপেটারিয়াস) এর বৃহৎ অ্যাম্পুলা গ্রন্থি থেকে আবরণ সংগ্রহ করা হয়েছিল।আবরণগুলি 20 mM Tris-HCl বাফারে 50 mg/mL (মাপা শুষ্ক ওজনের উপর ভিত্তি করে) সংরক্ষণ করা হয়েছিল, কিন্তু 37 °C (পরিপূরক চিত্র 2a) এ 21 দিনের ইনকিউবেশনের সময় কোনও জেলেশন পরিলক্ষিত হয়নি।
এই জেলগুলির পরিমাণ নির্ধারণের জন্য, জেলেশন প্রক্রিয়া অধ্যয়ন করতে এবং সামগ্রিক যান্ত্রিক বৈশিষ্ট্যগুলি নির্ধারণ করতে rheological পরিমাপ ব্যবহার করা যেতে পারে।বিশেষত, উচ্চ তাপমাত্রায় স্টোরেজ মডুলাস (স্থিতিস্থাপকতা) পর্যবেক্ষণ করা জেলিং তাপমাত্রার পাশাপাশি আবরণের ভিসকোয়েলাস্টিক বৈশিষ্ট্য সম্পর্কে তথ্য সরবরাহ করতে পারে।তাপমাত্রা বৃদ্ধি পরীক্ষা (প্রাকৃতিক সিল্ক স্টক সলিউশন ব্যবহার করে পূর্ববর্তী গবেষণার উপর ভিত্তি করে 25-45°C তাপমাত্রায় 1°C/মিনিট ব্যবহার করে) 40,41 দেখায় যে হিস-NT2RepCT এবং NT সলিউশনের স্টোরেজ মডিউলি তাপমাত্রা বৃদ্ধির সাথে বৃদ্ধি পেয়েছে।বৃদ্ধি করা হয়েছিল (চিত্র 2 এবং পরিপূরক চিত্র 3)।উল্লেখযোগ্যভাবে, এনটি মডিউল His-NT2RepCT-এর তুলনায় কম তাপমাত্রায় বৃদ্ধি পেতে শুরু করেছে, যখন এনটি সরাসরি His-NT2RepCT-এর সাথে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস (চিত্র 1) এ ইনকিউব করা হয়েছিল তখন দ্রুত জেল সময়ের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।তাপমাত্রার পরবর্তী হ্রাসের পরে, স্টোরেজ মডুলাসটি নিম্ন মানগুলিতে ফিরে আসেনি এবং ক্ষতির মডুলাসের উপরে থাকে (দেখুন পরিপূরক চিত্র 3), তাপীয়ভাবে অপরিবর্তনীয় স্থিতিশীল জেলেশন নির্দেশ করে।জেলেশনের পর, 100-500 mg/mL ঘনত্বে His-NT2RepCT হাইড্রোজেলের জন্য চূড়ান্ত ইলাস্টিক মডুলাস 15 থেকে 330 kPa পর্যন্ত এবং NT হাইড্রোজেলের জন্য চূড়ান্ত ইলাস্টিক মডুলাস (100-500 mg/mL) 2 থেকে 2 থেকে 2 পর্যন্ত। kPa (চিত্র , 2 এবং সম্পূর্ণ র‌্যাম্প ডেটা) পরিপূরক চিত্র 3 দেখুন)।
হিস-NT2RepCT (300 mg/mL) এবং b NT (300 mg/mL) ঝাঁকুনি সহ পরিমাপের সময় তাপমাত্রার পরিবর্তন।তীরগুলি তাপমাত্রার প্রবণতা নির্দেশ করে এবং স্টোরেজ মডিউল ডেটার হালকা শেডিং নির্মাতার দ্বারা নির্দিষ্ট করা যন্ত্রের জন্য কম টর্ক মানগুলিতে পরীক্ষাকে চিত্রিত করে, যা বর্ধিত শব্দের কারণ।c উচ্চ তাপমাত্রার (100, 300, এবং 500 mg/mL) পরে His-NT2RepCT এবং NT এর শেষ-মডিউল জমে।সমস্ত মডিউল রিডিং 0.1 Hz এর ফ্রিকোয়েন্সিতে নেওয়া হয়।
জেলেশনের সাথে সম্পর্কিত গঠনগত পরিবর্তনগুলি তদন্ত করার জন্য একটি সম্ভাব্য পদ্ধতি হিসাবে, আমরা 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে (চিত্র 3a, b) জেলেশনের আগে এবং পরে His-NT2RepCT এবং NT এর FTIR স্পেকট্রা রেকর্ড করেছি।প্রত্যাশিত হিসাবে, His-NT2RepCT এবং NT সলিউশনের বর্ণালী α-হেলিক্স/এলোমেলো কয়েল সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার দেখানো প্রোটিনের সাথে মিলে যায়, যার একটি উচ্চারিত ব্যান্ড 1645 সেমি-1।উভয় হাইড্রোজেলের জন্য, জেলেশনের ফলে মধ্যম I ব্যান্ডে প্রায় 1617 সেমি-1 এবং 1695 সেমি-1 (চিত্র 3a, b) দুটি বাহু তৈরি হয়, যা অ্যান্টি-প্যারালাল β-শীট ​​কাঠামোর গঠন নির্দেশ করে।এই পরিবর্তনগুলি সংশ্লিষ্ট দ্বিতীয় ডেরিভেটিভ এবং ডিফারেন্স জেলেশন স্পেকট্রাতেও স্পষ্টভাবে দেখা যায় (পরিপূরক চিত্র 4b)।NT β-স্তরের দুটি ব্যান্ড His-NT2RepCT এর চেয়ে বেশি উচ্চারিত ছিল, যা ইঙ্গিত করে যে NT হাইড্রোজেলে β-স্তর ব্যান্ডের মোট বিষয়বস্তু NT2RepCT হাইড্রোজেলের চেয়ে বেশি।
একটি FTIR শোষণ স্পেকট্রা His-NT2RepCT এবং b NT (উভয় 500 mg/mL) আগে (সমাধান) এবং (জেল) 37°C এ ইনকিউবেশনের পরে।c পুনরায় সাসপেন্ড করা 50 mg/ml NT2RepCT জেল এবং d NT এর TEM চিত্র।স্কেল বার 200 এনএম।e His-NT2RepCT এবং NT হাইড্রোজেলের ফাইবারের ব্যাস।n = 100 মাপা ফাইব্রিল, p < 0.0001।ত্রুটি বারগুলি আদর্শ বিচ্যুতি দেখায়।ত্রুটি বারের কেন্দ্র হল গড়।পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য একটি জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা (দুই-টেইলড) ব্যবহার করা হয়েছিল।f বিভিন্ন রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন প্রোটিন (100 mg/mL) এর ThT ফ্লুরোসেন্স 37 °C এ কাঁপুনি ছাড়াই।g NT (100 mg/mL) 0%, 5%, 10%, এবং 20% বীজ সহ 100 mg/mL NT জেল থেকে ইনোকুলেশন পরীক্ষা।
ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (টিইএম) ব্যবহার করে জেলের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে হাইড্রোজেলে অ্যামাইলয়েড-সদৃশ ফাইব্রিল রয়েছে (Figs. 3c, 3d)।এনটি-গঠিত ফাইব্রিলগুলি দীর্ঘায়িত ছিল (5-12 এনএম ব্যাস) এবং শাখাবিহীন, যখন হিস-এনটি 2 রেপসিটি ফাইব্রিলগুলি দৈর্ঘ্যে ছোট এবং ব্যাসে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রশস্ত (7-16 এনএম) (চিত্র 3e)।এই ফলাফলগুলি আমাদের থিওফ্লাভিন টি (ThT) অ্যাস ব্যবহার করে ফাইব্রোসিসের গতিবিদ্যা অনুসরণ করতে দেয়।সমস্ত রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন প্রোটিনের জন্য, ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যাল বৃদ্ধি পায় যখন নমুনাগুলি 37 °সে (চিত্র 3f, পরিপূরক চিত্র 5a) এ ইনকিউব করা হয়।এই অনুসন্ধানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, জেলিং অবস্থার অধীনে NT এবং His-NT2RepCT-এর অণুবীক্ষণিক পরীক্ষায় ThT-পজিটিভ সমষ্টির লক্ষণীয় স্থানীয় জমা (পরিপূরক চিত্র 5b,c) ছাড়াই ThT ফ্লুরোসেন্সে অভিন্ন বৃদ্ধি পাওয়া গেছে।ThT-পজিটিভ ফাইব্রিল গঠনের সাথে এনটি এবং হিস-এনটিসিটি টার্বিডিটি (পরিপূরক চিত্র 5d) বৃদ্ধি পায় না, যার অর্থ জেলের স্বচ্ছতার সাথে আপস না করেই জেলে ফাইব্রিলের একটি নেটওয়ার্ক তৈরি হতে পারে।অল্প পরিমাণে প্রাক-গঠিত ফাইব্রিল যোগ করে বীজ বপন করা কিছু অ্যামাইলয়েডের ফাইব্রিল গঠনকে উল্লেখযোগ্যভাবে ত্বরান্বিত করতে পারে 42,43,44 কিন্তু এনটি হাইড্রোকোয়াগুল্যান্টের দ্রবণে 5%, 10% বা 20% (w/w) NT যোগ করে।বীজের প্রভাব (চিত্র 3 গ্রাম)।সম্ভবত এটি এই কারণে যে হাইড্রোজেলে ফাইব্রিলগুলি তুলনামূলকভাবে স্থির এবং বীজ হিসাবে ব্যবহার করা যায় না।
উচ্চ তাপমাত্রায় রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন প্রোটিনের অপ্রত্যাশিত আচরণ জেল গঠনের সাথে সম্পর্কিত গঠনগত পরিবর্তনগুলি সনাক্ত করতে আরও পারমাণবিক চৌম্বকীয় অনুরণন (NMR) স্পেকট্রোস্কোপি অধ্যয়নকে প্ররোচিত করে।সময়ের সাথে সাথে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে রেকর্ড করা His-NT2RepCT সমাধানগুলির NMR স্পেকট্রা দেখায় যে CT এখনও আংশিকভাবে ভাঁজ করা হয়েছিল, যেখানে NT এবং 2Rep সংকেতগুলি অদৃশ্য হয়ে গিয়েছিল (চিত্র 4a), পরামর্শ দেয় যে এটি মূলত NT এবং 2Rep যা আংশিকভাবে হিস-এর গঠন নিয়ন্ত্রণ করে। NT2RepCT হাইড্রোজেল।সিটি সিগন্যালটিকে তার মূল তীব্রতার 20% এও কমানো হয়েছিল, এটি পরামর্শ দেয় যে সিটিও বেশিরভাগই স্থির এবং হাইড্রোজেল কাঠামোতে অন্তর্ভুক্ত।সিটির একটি ছোট অংশের জন্য, যা প্রি-ইনকিউবেটেড নমুনার মতো মোবাইল এবং এইভাবে সমাধান NMR দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হয়, স্পেকট্রাতে প্রথম 10টি কাঠামোগত অবশিষ্টাংশের জন্য সংকেত নেই, সম্ভবত His-NT2Rep-এর সংযুক্ত অংশের কঠিন অস্থিরকরণের কারণে।এনএমআর স্পেকট্রা -স্টেট অফ হাইড্রোজেল -NT2RepCT α-হেলিসেস এবং β-স্তরগুলির প্রধান উপস্থিতি প্রকাশ করে এবং কিছুটা হলেও, এলোমেলো কয়েল কনফর্মেশন (চিত্র 4b)।শুধুমাত্র এনটিতে উপস্থিত মেথিওনিনের অবশিষ্টাংশের রাসায়নিক পরিবর্তন বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এই ডোমেনটি একটি β-শীট ​​কাঠামোতে রূপান্তরিত হয়েছে।দ্রবণে এনটি-এর সময়-নির্ভর বর্ণালী সিগন্যালের তীব্রতা (চিত্র 4c) একটি অভিন্ন হ্রাস দেখিয়েছে এবং এনটি হাইড্রোজেলের সলিড-স্টেট এনএমআর দেখিয়েছে যে বেশিরভাগ এনটি অবশিষ্টাংশ β-শীট ​​কাঠামোতে রূপান্তরিত হয়েছে (চিত্র 4d)।2Rep এর গঠন আলাদাভাবে নির্ণয় করা যায়নি এর একত্রিত করার প্রবণতার কারণে।যাইহোক, NTCT এবং His-NT2RepCT হাইড্রোজেলের কঠিন অবস্থা NMR স্পেকট্রা দেখতে অনেকটা একই রকম ছিল (চিত্র 4b; পরিপূরক চিত্র 6b), পরামর্শ দেয় যে 2Rep His-NT2RepCT হাইড্রোজেলের কাঠামোগত অংশে সামান্য অবদান রাখে।সিটি হাইড্রোজেলের জন্য, α-হেলিসেস, β-শীট ​​এবং এলোমেলো হেলিকাল সেকেন্ডারি স্ট্রাকচারের অস্তিত্ব পাওয়া গেছে (পরিপূরক চিত্র 6d)।এটি পরামর্শ দেয় যে সিটির কিছু অংশ α-হেলিসে থাকে যখন অন্যরা β-শীট ​​হয়ে যায়।এইভাবে, এনএমআর স্পেকট্রোস্কোপির ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে এনটি হাইড্রোজেল গঠনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ এবং এটি 2Rep এবং CT এর সাথে ফিউশনের পরে একটি β-শীট ​​কনফর্মেশনে রূপান্তরিত হয়।এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, আমরা সম্প্রতি দেখতে পেয়েছি যে এনটি ডোমেনের পাঁচটি হেলিসেই অ্যামাইলয়েড স্থানিক জিপারগুলি তৈরি হতে পারে এবং ওয়াল্টজ অ্যালগরিদম হেলিক্স 1 (চিত্র 4e) এ একটি অ্যামাইলয়েডোজেনিক অঞ্চলের পূর্বাভাস দিয়েছে।
15N-HSQC এর 2D স্পেকট্রা 10 mg/mL His-NT2RepCT দ্রবণের আগে (নীল) এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউবেশনের (লাল) 19 ঘন্টা পরে।লাল বর্ণালীতে পৃথক ক্রস শিখর এবং নীল বর্ণালীতে F24, G136, polyA একক অক্ষর অ্যামিনো অ্যাসিড চিহ্ন এবং অবশিষ্টাংশ সংখ্যা দ্বারা চিহ্নিত করা হয়।ইনসেটগুলি NT, 2Rep, এবং CT ডোমেনগুলি থেকে নির্বাচিত অবশিষ্টাংশগুলির জন্য সময়মতো সংকেতের তীব্রতার নির্ভরতা দেখায়৷খ হিস-এনটি 2 রেপসিটি হাইড্রোজেলের সলিড-স্টেট রেডিওফ্রিকোয়েন্সি (আরএফডিআর) স্পেকট্রা।RFDR স্পেকট্রাতে পরিলক্ষিত Cα/Cβ অবশিষ্টাংশের পারস্পরিক সম্পর্ক মডেল পেপটাইড রাসায়নিক পরিবর্তন এবং পরিসংখ্যান 82,83 এবং তাদের গৌণ কাঠামো থেকে প্রাপ্ত মানগুলির সাথে তুলনা করে নির্ধারিত হয়েছিল।SSB - ঘোরানো সাইডব্যান্ড।c 15N-HSQC 10 mg/mL NT দ্রবণের এক-মাত্রিক বর্ণালী 37 °C তাপমাত্রায় 36 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেশনের সময়।ইনসেট সময় বনাম ভলিউমেট্রিক তীব্রতা দেখায়।d NT হাইড্রোজেলের সলিড স্টেট RFDR স্পেকট্রা।RFDR বর্ণালীতে পরিলক্ষিত Cα/Cβ অবশিষ্টাংশ এবং তাদের গৌণ কাঠামোর পারস্পরিক সম্পর্ক নির্দেশিত হয়।e Zipper ডাটাবেস (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) থেকে NT45.79 ফাইব্রিলেশন প্রপেনসিটি প্রোফাইলের উপর ভিত্তি করে।হেক্সাপেপটাইডের স্থানিক বিদ্যুতের শিফট উইন্ডোর রোসেটা শক্তি kcal/mol এ দেখানো হয়েছে।লাল বারগুলি উচ্চ ফাইব্রোসিস প্রবণতা সহ হেক্সাপেপ্টাইডগুলিকে নির্দেশ করে (রোসেটা শক্তি -23 kcal/mol এর নীচে; ডটেড লাইনের নীচে)।সবুজ বারগুলি থ্রেশহোল্ডের উপরে রোসেটা শক্তি সহ খণ্ডগুলি নির্দেশ করে এবং তাই স্টেরিক জিপার গঠনের সম্ভাবনা কম।প্রোলিনযুক্ত টুকরোগুলি বিশ্লেষণ থেকে বাদ দেওয়া হয়েছিল (কলাম ছাড়াই)।বর্গক্ষেত্রগুলি ওয়াল্টজ অ্যালগরিদম81 (https://waltz.switchlab.org) দ্বারা ভবিষ্যদ্বাণী করা অ্যামাইলয়েডোসিসের ক্ষেত্রগুলি নির্দেশ করে।এনটি-এর অ্যামিনো অ্যাসিডের অবশিষ্টাংশের ক্রমটি শীর্ষে রয়েছে এবং β সেকেন্ডারি কাঠামোতে পাওয়া অবশিষ্টাংশের ধরনগুলি (সলিড-স্টেট NMR স্পেকট্রোস্কোপি দ্বারা নির্ধারিত) লাল রঙে দেখানো হয়েছে।পাঁচটি NT α-হেলিসের অবস্থান (H1-H5)28 হিসাবে মনোনীত করা হয়েছে।
pH <6.5 এ, এইচটি ডাইমারাইজ হয়, তাপ- বা ইউরিয়া-প্ররোচিত বিকৃতকরণের বিরুদ্ধে প্রতিরোধী হয়।এনটি ডাইমারাইজেশন এবং স্থায়িত্ব কীভাবে জেলেশনকে প্রভাবিত করে তা ব্যাখ্যা করার জন্য, 100 মিলিগ্রাম/মিলি এনটি সমন্বিত সমাধানগুলি পিএইচ 8, 7 এবং 6 এ শিশির বিপরীত পরীক্ষা ব্যবহার করে নিয়ন্ত্রণ করা হয়েছিল।এনটি নমুনাগুলি পিএইচ 8 এবং 7 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 30 মিনিটের পরে জেল করা হয়েছিল, কিন্তু পিএইচ 8 জেলটি পরিষ্কার ছিল, যখন পিএইচ 7 জেলটি একটি দৃশ্যমান অবক্ষয় দেখায় (চিত্র 5a)।বিপরীতে, pH 6-এ HT ধারণকারী একটি দ্রবণ একটি জেল গঠন করে না এবং 37°C তাপমাত্রায় 20 মিনিটের পরে একটি বড় বর্ষণ দেখা যায়।এটি পরামর্শ দেয় যে ডাইমারগুলি নিজেরাই এবং/অথবা মনোমারের তুলনায় তাদের উচ্চ স্থিতিশীলতা জেলেশন প্রতিরোধ করে।পিএইচ 7 এবং 6-এ এনটি-এর জন্য একটি অবক্ষয় গঠন প্রত্যাশিত ছিল না, যেহেতু রিপোর্ট করা হয়েছে যে এনটি 200 মিলিগ্রাম/মিএল 27 এ দ্রবণীয়, তাপ বিকৃত হওয়ার পরে সহজেই পুনরায় ফোল্ড হয় এবং এর নিম্ন মানগুলিতে একটি α-হেলিক্স ধরে রাখে pH 18. এই অসঙ্গতির জন্য একটি সম্ভাব্য ব্যাখ্যা হল যে পূর্বে রিপোর্ট করা পরীক্ষাগুলি ঘরের তাপমাত্রায় বা তার নিচে বা তুলনামূলকভাবে কম প্রোটিন ঘনত্ব 16,18,19 এ করা হয়েছিল।
এনটি ভায়াল ইনভার্সন টেস্ট (100 mg/mL) pH 8, 7, 6 এবং 154 mM NaCl (pH 8) 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউবেশনের পর।b NT CD স্পেকট্রা যথাক্রমে 154 mM NaF এবং 154 mM NaCl সহ এবং ছাড়া।222 nm এ মোলার উপবৃত্তাকার প্রাকৃতিক ভাঁজের অনুপাতে রূপান্তরিত হয়।c NT ইনভার্সন অ্যাস (100 mg/mL) NT* (37 °C এবং 60 °C), NTA72R (37 °C), এবং His-NT-L6 (37 °C এবং 60 °C)।d NT মিউট্যান্ট NT*, NTA72R, এবং His-NT-L6 এর CD স্পেকট্রা।222 nm এ মোলার উপবৃত্তাকার প্রাকৃতিক ভাঁজের অনুপাতে রূপান্তরিত হয়।e NTFlSp, NTMiSp এবং হ্রাসকৃত NTMiSp (100 mg/mL) এর বিপরীত পরীক্ষা।স্কেল বার 5 মিমি।f NT এর CD স্পেকট্রা, NTFlSp, NTMiSp এবং হ্রাসকৃত NTMiSp।222 nm এ মোলার উপবৃত্তাকার প্রাকৃতিক ভাঁজের অনুপাতে রূপান্তরিত হয়।পরিপূরক চিত্র 8-এ 25 °C এবং 95 °C এ সম্পূর্ণ NT স্পেকট্রা দেখানো হয়েছে।
শারীরবৃত্তীয় লবণের ঘনত্ব এনটি সাবইউনিটের মধ্যে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া নির্ধারণ করে এবং নিম্ন pH18-এ এনটি স্থানান্তরের ডাইমারাইজেশন।আমরা দেখতে পেয়েছি যে 154 mM NaCl এবং NaF এর উপস্থিতি যথাক্রমে জেলেশনকে বাধা দেয় (চিত্র 5a, b; পরিপূরক চিত্র 2b) এবং এই লবণগুলি NT মনোমারের তাপীয় স্থিতিশীলতা বাড়িয়েছে (চিত্র 5b, পরিপূরক চিত্র 8) .এটি আরও পরামর্শ দেয় যে ডাইমারাইজেশনের পরিবর্তে স্থিতিশীলতা বৃদ্ধি জেল গঠনকে বাধা দেয়।
জেলেশনে প্রোটিন ডাইমারাইজেশন এবং স্থিতিশীলতার ভূমিকা আরও অন্বেষণ করার জন্য, আমরা দুটি মিউট্যান্ট, NT* এবং NTA72R ব্যবহার করেছি, যেগুলি কম pH28.30 এও মনোমেরিক থাকে।NT* হল একটি ডাবল চার্জ রিভার্সাল মিউট্যান্ট যাতে মনোমারের আপাত দ্বিপোলার চার্জ বন্টন চ্যাপ্টা হয়, যা ডাইমারাইজেশন প্রতিরোধ করে এবং মনোমারের স্থায়িত্বকে ব্যাপকভাবে বৃদ্ধি করে।NTA72R একটি চার্জযুক্ত ডাইপোল, কিন্তু Arg-প্রতিস্থাপিত আলা ডাইমার সীমানায় অবস্থিত, তাই মিউটেশনগুলি ডাইমারাইজেশনের জন্য প্রয়োজনীয় সাবইউনিট ইন্টারঅ্যাকশনগুলিতে হস্তক্ষেপ করে।37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউবেশনের পরে, NT* একটি হাইড্রোজেল তৈরি করে না, যখন NTA72R 15 মিনিটের জন্য একটি অস্বচ্ছ জেল তৈরি করে (চিত্র 5c)।যেহেতু NT* এবং NTA72R উভয়ই ডাইমারাইজ করতে পারে না তবে মনোমার স্থায়িত্বের মধ্যে পার্থক্য (চিত্র 5d), এই ফলাফলগুলি দৃঢ়ভাবে পরামর্শ দেয় যে উচ্চ থার্মোডাইনামিক স্থিতিশীলতা এনটি কে জেলিং থেকে বাধা দেয়।এটি এই সত্য দ্বারাও সমর্থিত যে HT* একটি জেল গঠন করে যখন এটি উচ্চ তাপমাত্রায় অস্থির থাকে (8 মিনিটের পরে 60°C; চিত্র 5c)।এটি পূর্বে দেখা গেছে যে এনটিতে মেথিওনিনের উচ্চ উপাদান এটির প্রাকৃতিক ভাঁজকে তরল করে এবং ছয়টি মেট টু লিউ বিকল্প (এখানে হিস-এনটি-এল6 হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে) এনটি 46 মনোমারকে দৃঢ়ভাবে স্থিতিশীল করে।এনটি জেল গঠনের জন্য কাঠামোগত নমনীয়তা প্রয়োজন এমন ধারণার উপর ভিত্তি করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে His-NT-L6 স্থিতিশীল মিউট্যান্ট 37 °C (চিত্র 5c, d) এ জেল করেনি।যাইহোক, His-NT-L6 এছাড়াও 60 °С তাপমাত্রায় 60 মিনিটের জন্য ইনকিউবেশনের সময় একটি জেল তৈরি করে (চিত্র 5c)।
এনটি-এর β-শীট ​​কাঠামোতে রূপান্তরিত হওয়ার এবং হাইড্রোজেল গঠনের ক্ষমতা কিছু কিছুতে প্রযোজ্য বলে মনে হয় কিন্তু স্পাইড্রয়েনের সমস্ত এনটি ডোমেনে নয়।বিভিন্ন ধরণের রেশম এবং মাকড়সার প্রজাতির এনটি, ট্রাইকোনেফিলা ক্ল্যাভিপস (এনটিএফএলএসপি), তাদের তুলনামূলকভাবে কম মেথিওনিন উপাদান এবং উচ্চ তাপীয় স্থিতিশীলতা থাকা সত্ত্বেও জেল তৈরি করে (চিত্র 5e, f এবং পরিপূরক সারণী 2)।বিপরীতে, কম তাপীয় স্থিতিশীলতা এবং উচ্চ মেথিওনিন উপাদান সহ অ্যারেনিয়াস ভেন্ট্রিকোসাস (এনটিএমআইএসপি) থেকে ছোট অ্যামপুলার প্রোটিন স্পাইড্রয়েন থেকে এনটি হাইড্রোজেল গঠন করেনি (পরিপূরক সারণী 2 এবং চিত্র 5e, f)।পরবর্তীটি ইন্ট্রামলিকুলার ডিসালফাইড বন্ড 29,47 এর উপস্থিতির সাথে যুক্ত হতে পারে।ধারাবাহিকভাবে, যখন NTMiSp-এর ডিসালফাইড বন্ধন হ্রাস করা হয়েছিল, তখন এটি 10 ​​মিনিটের জন্য (চিত্র 5e) 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউবেশনের পরে একটি হাইড্রোজেল তৈরি করেছিল।উপসংহারে, এটি লক্ষ করা উচিত যে কাঠামোগত নমনীয়তা একটি গুরুত্বপূর্ণ, কিন্তু একমাত্র নয়, এনটি থেকে জেল তৈরির মাপকাঠি।আরেকটি বিষয় যা প্রাসঙ্গিক হতে পারে তা হল অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিল গঠনের প্রবণতা, এবং জিপার ডাটাবেস এবং ওয়াল্টজ অ্যালগরিদমের বিশ্লেষণে জেল গঠনের ক্ষমতা এবং অ্যামাইলয়েডোজেনিক অঞ্চলের উপস্থিতির সাথে সাথে ভবিষ্যদ্বাণী করা অঞ্চলগুলির পরিমাণের মধ্যে একটি সম্পর্ক দেখায়। স্টেরিক জিপার গঠন করতে।একটি পারস্পরিক সম্পর্ক ছিল (পরিপূরক সারণী 2 এবং পরিপূরক চিত্র 9)।
এনটি-এর ফাইব্রিল গঠনের ক্ষমতা এবং অনুকূল পরিস্থিতিতে জেল তৈরি করার ক্ষমতা আমাদের অনুমান করতে চালিত করে যে অন্যান্য প্রোটিন টুকরোগুলির সাথে এনটি ফিউশন এখনও ফিউশন অংশীদারদের সম্পূর্ণ কার্যকারিতা সহ জেল গঠন করতে পারে।এটি পরীক্ষা করার জন্য, আমরা যথাক্রমে এনটি-এর সি-টার্মিনাসে সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) এবং পিউরিন নিউক্লিওসাইড ফসফোরাইলেস (PNP) প্রবর্তন করেছি।ফলস্বরূপ ফিউশন প্রোটিনগুলি E. coli-তে প্রকাশ করা হয়েছিল খুব উচ্চ চূড়ান্ত ফলন সহ (His-NT-GFP এবং His-NT-PNP এর জন্য যথাক্রমে 150 mg/L এবং 256 mg/L শেক ফ্লাস্ক কালচার), যা দেখানো হয়েছে তার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এনটি রেফের সাথে মিশ্রিত অন্যান্য প্রোটিনের জন্য।30. His-NT-GFP (300mg/mL) এবং His-NT-PNP (100mg/mL) ফিউশন প্রোটিন 37°C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা এবং 6.5 ঘন্টা পরে জেল তৈরি করে এবং গুরুত্বপূর্ণভাবে, GFP ভগ্নাংশ অপরিবর্তিত ছিল।জেলেশনের পরে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে, জেলেশনের পরে প্রাথমিক ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতার 70% অবশিষ্ট রয়েছে (চিত্র 6a)।তার-এনটি-পিএনপি সলিউশন এবং জেলগুলিতে পিএনপি কার্যকলাপ পরিমাপ করার জন্য, আমাদের ফিউশন প্রোটিনকে এনটি দিয়ে পাতলা করতে হয়েছিল কারণ বিশুদ্ধ প্রস্তুতির এনজাইমেটিক কার্যকলাপ জেলিং ঘনত্বে অ্যাসের সনাক্তকরণ সীমার বাইরে ছিল।0.01 mg/mL His-NT-PNP এবং 100 mg/mL NT সমন্বিত একটি মিশ্রণের সাথে গঠিত জেলটি প্রি-ইনকিউবেটেড নমুনার প্রাথমিক এনজাইমেটিক কার্যকলাপের 65% ধরে রাখে (চিত্র 6b)।পরিমাপের সময় জেলটি অক্ষত ছিল (পরিপূরক চিত্র 10)।
হিস-এনটি-জিএফপি (300 মিলিগ্রাম/মিলি) এবং হিস-এনটি-জিএফপি হাইড্রোজেল (300 মিলিগ্রাম/মিলি) দৃশ্যমান এবং অতিবেগুনী আলোর অধীনে থাকা উল্টানো শিশির জেলেশনের আগে এবং পরে একটি আপেক্ষিক ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা।পয়েন্টগুলি পৃথক পরিমাপ দেখায় (n = 3), ত্রুটি বারগুলি আদর্শ বিচ্যুতি দেখায়।গড় মান ত্রুটি বার কেন্দ্রে দেখানো হয়.b PNP কার্যকলাপ এনটি (100 mg/ml) এবং 0.01 mg/ml his-NT-PNP এবং 100 mg/ml নতুন তাইওয়ান ডলার সমন্বিত সমাধান এবং জেল ব্যবহার করে ফ্লুরোমেট্রিক বিশ্লেষণের মাধ্যমে প্রাপ্ত করা হয়েছিল।ইনসেটটি হিস-এনটি-পিএনপি (5 মিমি স্কেল বার) ধারণকারী একটি হাইড্রোজেল ধারণকারী একটি উল্টানো শিশি দেখায়।
এখানে, আমরা 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস (চিত্র 1) এ একটি প্রোটিন দ্রবণ ইনকিউব করে এনটি এবং অন্যান্য রিকম্বিন্যান্ট স্পাইড্রয়েন প্রোটিন থেকে হাইড্রোজেল গঠনের রিপোর্ট করি।আমরা দেখাই যে জেলেশন α-হেলিসের β-স্তরে রূপান্তর এবং অ্যামাইলয়েড-সদৃশ ফাইব্রিল (ডুমুর 3 এবং 4) গঠনের সাথে জড়িত।এই আবিষ্কারটি আশ্চর্যজনক কারণ এনটিগুলি কুন্ডলযুক্ত গ্লোবুলার ফাইভ-হেলিক্স বান্ডিল যা তাদের অত্যন্ত উচ্চ দ্রবণীয়তা এবং ঘনত্বে উচ্চ স্থিতিশীলতার জন্য পরিচিত > 200 mg/mL 4°C তাপমাত্রায় বেশ কিছু দিন 27৷এছাড়াও, এনটিগুলি µM-এ কম প্রোটিন ঘনত্বে তাপ বিকৃতকরণের পরে সহজেই পুনরায় ফোল্ড হয়।আমাদের ফলাফল অনুসারে, ফাইব্রিল গঠনের জন্য প্রয়োজন >10 মিলিগ্রাম/মিলি প্রোটিন ঘনত্ব এবং সামান্য উচ্চ তাপমাত্রা (চিত্র 1)।এটি এই ধারণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিলগুলি গ্লোবুলারিভাবে ভাঁজ করা প্রোটিন থেকে তৈরি হতে পারে যা শারীরবৃত্তীয় অবস্থার অধীনে তাপীয় ওঠানামার কারণে আংশিকভাবে উদ্ভাসিত অবস্থায় থাকে 48।এই রূপান্তরের মধ্য দিয়ে প্রোটিনের উদাহরণগুলির মধ্যে রয়েছে insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin এবং lysozyme51,52,53।যদিও এনটি তার স্থানীয় অবস্থায় একটি α-হেলিক্স, প্রায় 65% পলিপেপটাইড চেইন স্টেরিক জিপার গঠন (চিত্র 4e) 45 এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।যেহেতু মনোমারটি গতিশীলভাবে মোবাইল 46, এটি এই সম্ভাব্য অ্যামাইলয়েডোজেনিক অঞ্চলগুলিকে মাঝারিভাবে উচ্চতর তাপমাত্রায় প্রকাশ করতে পারে এবং মোট প্রোটিনের উচ্চ ঘনত্বে অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিল গঠনের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ ঘনত্বে পৌঁছাতে পারে54।এই যুক্তি অনুসরণ করে, আমরা স্পাইড্রয়েনের ঘনত্ব এবং জেলেশন সময়ের (চিত্র 1c) মধ্যে একটি নেতিবাচক সম্পর্ক খুঁজে পেয়েছি, এবং যদি মনোমেরিক এনটি কনফরমেশনটি হয় মিউটেশন (NT*, His-NT-L6) বা লবণ যোগের মাধ্যমে স্থিতিশীল হয়, তাহলে তা প্রতিরোধ করতে পারে গঠন হাইড্রোজেল (চিত্র 5)।
বেশিরভাগ ক্ষেত্রে, অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিলগুলি দ্রবণ থেকে অবক্ষয় হিসাবে অদৃশ্য হয়ে যায়, তবে নির্দিষ্ট পরিস্থিতিতে তারা হাইড্রোজেল গঠন করতে পারে 55,56,57।হাইড্রোজেল-গঠনকারী ফাইব্রিলগুলির সাধারণত উচ্চ আকৃতির অনুপাত থাকে এবং আমাদের ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ 55,58 আণবিক এনট্যাঙ্গলমেন্টের মাধ্যমে স্থিতিশীল ত্রি-মাত্রিক নেটওয়ার্ক গঠন করে।ভিট্রোতে হাইড্রোজেল গঠনের জন্য, প্রোটিনগুলি প্রায়শই সম্পূর্ণ বা আংশিকভাবে উন্মোচিত হয়, উদাহরণস্বরূপ, জৈব দ্রাবকের সংস্পর্শে, উচ্চ তাপমাত্রা (70-90°C) এবং/অথবা নিম্ন pH (1.5–3.0)59,60,61,62।এখানে বর্ণিত স্পাইড্রয়েন হাইড্রোজেলগুলির কঠোর প্রক্রিয়াকরণের প্রয়োজন হয় না, বা হাইড্রোজেলগুলিকে স্থিতিশীল করার জন্য ক্রস-লিঙ্কিং এজেন্টগুলির প্রয়োজন হয় না।
এটি পূর্বে রিপোর্ট করা হয়েছে যে স্পাইড্রয়েন পুনরাবৃত্তি এবং QD, যা সিল্ক স্পিনিংয়ের সময় β-শীট ​​পরিবর্তনের মধ্য দিয়ে দেখা যায়, হাইড্রোজেল গঠন করে।আমাদের অনুসন্ধানের তুলনায়, ইনকিউবেশন সময় এবং/অথবা ইনকিউবেশন তাপমাত্রা যথাক্রমে উল্লেখযোগ্যভাবে দীর্ঘ বা বেশি ছিল এবং ফলস্বরূপ হাইড্রোজেলগুলি প্রায়শই অস্বচ্ছ ছিল (চিত্র 7 এবং পরিপূরক সারণী 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. দ্রুত জেলের সময় ছাড়াও, NT হাইড্রোজেল >300 mg/mL (30%) অন্যান্য সমস্ত বর্ণিত রিকম্বিন্যান্ট স্পাইডার সিল্ক প্রোটিন হাইড্রোজেল, সেইসাথে প্রাকৃতিক হাইড্রোজেল যেমন জেলটিন, অ্যালজিনেট (2%), আগর (0.5%) কে ছাড়িয়ে গেছে ) এবং কোলাজেন।(0.6%) (চিত্র 7 এবং পরিপূরক সারণী 1 এবং 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74।
এই গবেষণায় হাইড্রোজেলগুলির জেলের সময় এবং ইলাস্টিক মডুলাস অন্যান্য স্পাইড্রয়েন-ভিত্তিক হাইড্রোজেল এবং নির্বাচিত প্রাকৃতিক হাইড্রোজেলগুলির সাথে তুলনা করা হয়েছিল।জেলেশন অবস্থার বর্ণনা সহ রেফারেন্স দেওয়া হয়।এপিএস অ্যামোনিয়াম পারসালফেট, ঘরের তাপমাত্রা।ডেটা 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74।
মাকড়সা স্টোরেজ চলাকালীন জেলিং থেকে স্পাইড্রয়েন প্রতিরোধ করার উপায় তৈরি করেছে বলে মনে হচ্ছে।রেশম গ্রন্থিতে প্রোটিনের উচ্চ ঘনত্ব থাকা সত্ত্বেও, টার্মিনাল ডোমেনের সাথে যুক্ত বৃহৎ পুনরাবৃত্ত অঞ্চলের অর্থ হল এই গবেষণার সীমানায় গ্রন্থিতে NT এবং CT-এর আপাত ঘনত্ব প্রায় 10-20 mg/ml-এর সাথে মিলে যায়।ভিট্রো পর্যবেক্ষণ করা হাইড্রোজেল গঠনের জন্য প্রয়োজনীয়।উপরন্তু, লবণের অনুরূপ ঘনত্ব 16 এনটি স্থিতিশীল, যেমন রেশম গ্রন্থি (চিত্র 5বি)।E. coli cytosol-এ এনটি কনফর্মেশন অধ্যয়ন করা হয়েছে এবং ভিট্রোতে পরীক্ষা করার তুলনায় এটি আরও শক্তভাবে ভাঁজ করা হয়েছে, আরও ইঙ্গিত করে যে লবণ বা অন্যান্য কারণগুলি ভিভোতে এর একত্রীকরণকে বাধা দেয়।যাইহোক, NT-এর β-শীট ​​ফাইব্রিলে রূপান্তরিত করার ক্ষমতা ফিলামেন্ট গঠনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ হতে পারে এবং ভবিষ্যতের গবেষণায় তদন্ত করা উচিত।
এই গবেষণায় এনটি-অ্যামাইলয়েড-সদৃশ ফাইব্রিল এবং হাইড্রোজেল গঠনের অভিনব দিকগুলি ছাড়াও, আমরা এটিও দেখাই যে এই ঘটনাটির জৈবপ্রযুক্তিগত এবং জৈব চিকিৎসা অ্যাপ্লিকেশন থাকতে পারে (চিত্র 8)।ধারণার প্রমাণ হিসাবে, আমরা NT-কে GFP বা PNP-এর সাথে একত্রিত করেছি এবং দেখিয়েছি যে ফিউশন প্রোটিনও হাইড্রোজেল গঠন করে যখন 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউব করা হয় এবং GFP এবং PNP ভগ্নাংশগুলি জেলেশনের পরে তাদের ক্রিয়াকলাপ অনেকাংশে ধরে রাখে (চিত্র 6)।নিউক্লিওসাইড ফসফোরাইলেসগুলি হল নিউক্লিওসাইড অ্যানালগ75 এর গুরুত্বপূর্ণ অনুঘটক সংশ্লেষণ, যা আমাদের আবিষ্কারকে বায়োফার্মাসিউটিক্যাল শিল্পের জন্য প্রাসঙ্গিক করে তোলে।ফিউশন প্রোটিন প্রকাশ করার ধারণা যা অনুকূল পরিস্থিতিতে স্বচ্ছ হাইড্রোজেল গঠন করে এনজাইম অস্থিরকরণ, নিয়ন্ত্রিত ড্রাগ রিলিজ এবং টিস্যু ইঞ্জিনিয়ারিংয়ের মতো বিস্তৃত অ্যাপ্লিকেশনের জন্য অনুকূল বৈশিষ্ট্য সহ কার্যকরী হাইড্রোজেল তৈরি করতে দেয়।উপরন্তু, NT এবং NT* হল দক্ষ এক্সপ্রেশন মার্কার30, যার মানে হল NT এবং এর ভেরিয়েন্টগুলি দ্রবণীয় ফিউশন প্রোটিনের উচ্চ-থ্রুপুট উত্পাদন এবং 3D হাইড্রোজেলে স্থির লক্ষ্য প্রোটিন তৈরির জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।
NT দ্রবণীয়, α-হেলিকাল এবং কম ঘনত্ব (µM) এবং 37°C এ স্থিতিশীল।একই তাপমাত্রায়, কিন্তু ক্রমবর্ধমান ঘনত্বে (>10 মিলিগ্রাম/মিলি), এনটি অ্যামাইলয়েড-সদৃশ ফাইব্রিল সমন্বিত জেল তৈরি করে।এনটি ফিউশন প্রোটিনগুলি সম্পূর্ণ কার্যকরী ফিউশন টুকরোগুলির সাথে ফাইব্রিলার জেলও গঠন করে, যা এনটি ব্যবহার করে বিভিন্ন প্রোটিনকে 3D হাইড্রোজেলে স্থির করার অনুমতি দেয়।নীচে: NT (PDB: 4FBS) এবং ফাইবার নেটওয়ার্ক এবং সংশ্লিষ্ট প্রোটিন কাঠামোর চিত্র (অনুমান করা হয়েছে এবং স্কেলে আঁকা নয়, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.22210/pdbRJ)।
গঠনগুলি (অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্স সহ একটি সম্পূর্ণ তালিকার জন্য পরিপূরক সারণী 4 দেখুন) প্লাজমিড pT7 এ ক্লোন করা হয়েছিল এবং E. coli BL21 (DE3) এ রূপান্তরিত হয়েছিল।কানামাইসিন (70 মিলিগ্রাম/লি) এর সাথে সম্পূরক লুরিয়া ব্রোথে ই. কোলাই ইঞ্জিনযুক্ত প্লাজমিড ইনোকুলেট করা হয়েছিল এবং 30°C এবং 250 rpm-এ রাতারাতি বেড়ে ওঠে।তারপর কালচারটিকে 1/100 এলবি মিডিয়ামে ক্যানামাইসিনযুক্ত টিকা দেওয়া হয় এবং OD600 0.8 এ পৌঁছানো পর্যন্ত 30°C এবং 110 rpm-এ কালচার করা হয়।এনএমআর অধ্যয়নের জন্য, আইসোটোপগুলির সাথে প্রোটিন লেবেলিংয়ের জন্য ব্যাকটেরিয়াগুলি M9 ন্যূনতম মাঝারিতে জন্মানো হয়েছিল যাতে 2 গ্রাম ডি-গ্লুকোজ 13C (অলড্রিচ) এবং 1 গ্রাম অ্যামোনিয়াম ক্লোরাইড 15N (ক্যামব্রিজ আইসোটোপ ল্যাবরেটরিজ, ইনক.) থাকে।তাপমাত্রা 20 ডিগ্রি সেলসিয়াসে কমিয়ে আনুন এবং 0.15 মিমি আইসোপ্রোপাইলথিওগাল্যাকটোপিরানোসাইড (চূড়ান্ত ঘনত্ব) দিয়ে প্রোটিন প্রকাশ করুন।রাতারাতি প্রোটিন এক্সপ্রেশনের পরে, কোষগুলি 20 মিনিটের জন্য 7278×g, 4°C এ কাটা হয়েছিল।সেল পেলেটগুলি 20 মিমি ট্রিস-এইচসিএল, পিএইচ 8 এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং পরবর্তী ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত হিমায়িত করা হয়েছিল।গলিত কোষগুলি 30 kPa-এ সেল ডিসরাপ্টর (TS সিরিজ মেশিন, কনস্ট্যান্ট সিস্টেমস লিমিটেড, ইংল্যান্ড) ব্যবহার করে লাইজ করা হয়েছিল।তারপর লাইসেটগুলিকে 25,000 গ্রাম 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 30 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল।NTMiSp-এর জন্য, পেলেটটিকে 2 M ইউরিয়া, 20 mM Tris-HCl, pH 8 তে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং 2 মিনিটের জন্য (2 s অন/অফ, 65%), তারপরে আবার 25,000 xg, 4° C এর মধ্যে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। 30 মিনিট.সুপারনাট্যান্টটিকে একটি Ni-NTA কলামে লোড করা হয়েছিল, 20 mM Tris-HCl, 2 mM ইমিডাজল, pH 8 দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং অবশেষে প্রোটিনটিকে 20 mM Tris-HCl, 200 mM ইমিডাজল, pH 8 দিয়ে ধৃত করা হয়েছিল। NT2RepCT এবং উৎপন্ন করতে এনটিসিটি, থ্রম্বিন হজম তার এবং এনটির মধ্যে সাইট (থ্রক্লেভ) প্রবর্তন করে।থ্রোমবিন ক্লিভেজ সাইটগুলি হিস-এনটি-থ্রক্লেভ-2রিপ (2 রিপ উত্পাদন করে), হিস-থিওরেডক্সিন-থ্রক্লেভ-এনটি (এনটি উত্পাদন করে), হিস-থিওরেডক্সিন-থ্রক্লেভ-সিটি (সিটি উত্পাদন করে), হিস-থিওরেডক্সিন-থ্রক্লেভ-এনটিতেও উপস্থিত রয়েছে। .* (NT* উৎপন্ন করে), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R উৎপন্ন করে), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp উৎপন্ন করে), এবং হিস-সালফার রেডক্সিন-থ্রক্লেভ-এনটিএমআইএসপি (এনটিএমআইএসপি উৎপাদন করে)।থ্রম্বিন (1:1000) দিয়ে কনস্ট্রাক্টগুলি হজম করা হয়েছিল এবং 6-8 kDa এর আণবিক ওজন থ্রেশহোল্ড সহ একটি স্পেকট্রা/পোর ডায়ালাইসিস মেমব্রেন ব্যবহার করে 20 মিমি ট্রিস-এইচসিএল, পিএইচ 8 সহ 4° C এ রাতারাতি ডায়ালাইজ করা হয়েছিল।ডায়ালাইসিসের পরে, সমাধানটি একটি Ni-NTA কলামে লোড করা হয় এবং আগ্রহের প্রোটিন ধারণকারী বর্জ্য সংগ্রহ করা হয়।প্রোটিনের ঘনত্ব প্রতিটি প্রোটিনের বিলুপ্তি সহগ ব্যবহার করে 280 এনএম এ UV শোষণ পরিমাপ করে নির্ধারিত হয়েছিল, NTF1Sp ছাড়া, যা প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে ব্র্যাডফোর্ড অ্যাস ব্যবহার করেছিল।বিশুদ্ধতা SDS polyacrylamide (4-20%) জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস এবং Coomassie ব্রিলিয়ান্ট ব্লু স্টেনিং দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল।20 মিনিটের চক্রে 10 kDa আণবিক ওজন কাটঅফ সহ 4000 xg এ সেন্ট্রিফিউজ ফিল্টার (VivaSpin 20, GE Healthcare) ব্যবহার করে প্রোটিনগুলিকে কেন্দ্রীভূত করা হয়েছিল।
প্রোটিন দ্রবণটি গলিয়ে নিন এবং সাবধানে 150 μl একটি 1 মিলি পরিষ্কার সেপ্টাম শিশিতে (8 x 40 মিমি থার্মো সায়েন্টিফিক) পাইপেট করুন।বাষ্পীভবন রোধ করার জন্য টিউবগুলিকে প্যারাফিল্ম দিয়ে আটকানো এবং সিল করা হয়েছিল।নমুনাগুলি (n = 3) 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস বা 60 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং জেলেশন পর্যবেক্ষণের জন্য পর্যায়ক্রমে উল্টানো হয়েছিল।জেল হয়নি এমন নমুনাগুলি কমপক্ষে এক সপ্তাহের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল।প্রতি 10 µM প্রোটিনে 10 মিমি ডিটিটি সহ NTMiSp ডিসালফাইড বন্ড হ্রাস করুন।প্রাকৃতিক মাকড়সার রেশম আবরণের জেলেশন বিশ্লেষণ করার জন্য, সুইডিশ ব্রিজ স্পাইডারটি কাটা হয়েছিল, দুটি প্রধান অ্যামপুলেটেড গ্রন্থি 20 মিমি ট্রিস-এইচসিএল বাফার পিএইচ 8 এর 200 μl এ স্থাপন করা হয়েছিল এবং লেপটিকে গ্রন্থিগুলি থেকে আলাদা করার অনুমতি দেওয়ার জন্য কাটা হয়েছিল।.গ্রন্থিগুলির বিষয়বস্তু বাফারে দ্রবীভূত হয়, শুকনো ওজন নির্ধারণের জন্য 50 μl (ধ্রুব ওজন থেকে 60 ডিগ্রি সেলসিয়াসে খোলা শিশির ইনকিউবেশনের মাধ্যমে) এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে জেলেশনের জন্য 150 μl।
পরিমাপের জ্যামিতি/সরঞ্জামটি 20 মিমি উপরের ব্যাস এবং 0.5 মিমি ব্যবধান সহ একটি সমান্তরাল প্লেট ব্যবহার করে স্টেইনলেস স্টিলের তৈরি।একটি স্টেইনলেস স্টিলের নিচের পেল্টিয়ার প্লেট ব্যবহার করে নমুনাটিকে 25 °C থেকে 45 °C এবং প্রতি মিনিটে 1 °C হারে 25 °C এ ফিরে যান।কম্পনজনিত পরিমাপ 0.1 Hz এর ফ্রিকোয়েন্সিতে এবং উপাদানের রৈখিক ভিসকোয়েলাস্টিক অঞ্চলে যথাক্রমে 100 mg/mL এবং 300-500 mg/mL নমুনার জন্য 5% এবং 0.5% স্ট্রেনে পরিচালিত হয়েছিল।বাষ্পীভবন প্রতিরোধ করতে একটি কাস্টম আর্দ্রতা চেম্বার ব্যবহার করুন।প্রিজম 9 ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
800 থেকে 3900 সেমি-1 ঘরের তাপমাত্রায় ইনফ্রারেড (IR) স্পেকট্রা সংগ্রহের জন্য।এটিআর ডিভাইস, সেইসাথে স্পেকট্রোমিটারের মাধ্যমে আলোর পথ, পরীক্ষার আগে এবং চলাকালীন শুষ্ক ফিল্টার করা বাতাস দিয়ে পরিষ্কার করা হয়।সমাধানগুলি (স্পেকট্রাতে জল শোষণের শিখর কমানোর জন্য 500 mg/mL) স্ফটিকের উপর পাইপেটেড করা হয়েছিল, এবং জেলগুলি (500 mg/mL) পরিমাপের আগে গঠিত হয়েছিল এবং তারপরে স্ফটিকগুলিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল (n = 3)।2 cm-1 এর রেজোলিউশন এবং 2 এর শূন্য শুল্ক চক্রের সাথে 1000টি স্ক্যান রেকর্ড করা হয়েছিল। দ্বিতীয় ডেরিভেটিভটি নয়টি পয়েন্টের মসৃণ পরিসর ব্যবহার করে OPUS (Bruker) ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।1720 এবং 1580 cm-1 এর মধ্যে স্পেকট্রাকে একই ইন্টিগ্রেশন অঞ্চলে স্বাভাবিক করা হয়েছিল F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” ব্যবহার করে।ATR-IR স্পেকট্রোস্কোপিতে, একটি নমুনার মধ্যে একটি ইনফ্রারেড রশ্মির অনুপ্রবেশ গভীরতা তরঙ্গসংখ্যা নির্ভর, যার ফলে উচ্চতর তরঙ্গসংখ্যার তুলনায় নিম্নতর তরঙ্গসংখ্যায় শক্তিশালী শোষণ হয়।ডুমুরে দেখানো স্পেকট্রার জন্য এই প্রভাবগুলি সংশোধন করা হয়নি।3 কারণ তারা খুব ছোট (পরিপূরক চিত্র 4)।এই চিত্রের জন্য সঠিক স্পেকট্রা ব্রুকার ওপিএস সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।
নীতিগতভাবে, অ্যামাইড I শিখরের মধ্যে উপাদানগুলির নির্ভরযোগ্য ডিকনভোল্যুশনের পরে প্রোটিন কনফর্মেশনের একটি বিস্তৃত পরিমাণ নির্ধারণ করা সম্ভব।তবে অনুশীলনে কিছু প্রতিবন্ধকতা দেখা দেয়।ডিকনভোল্যুশনের সময় বর্ণালীতে শব্দ (মিথ্যা) শিখর হিসাবে প্রদর্শিত হতে পারে।উপরন্তু, জলের নমনের কারণে শিখরটি অ্যামাইড I শিখরের অবস্থানের সাথে মিলে যায় এবং এখানে অধ্যয়ন করা জলীয় জেলের মতো প্রচুর পরিমাণে জল ধারণকারী নমুনার জন্য একই মাত্রা থাকতে পারে।অতএব, আমরা অ্যামাইড I শিখরকে সম্পূর্ণরূপে পচানোর চেষ্টা করিনি এবং আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি শুধুমাত্র NMR স্পেকট্রোস্কোপির মতো অন্যান্য পদ্ধতির সমর্থনে বিবেচনা করা উচিত।
50 mg/ml NT এবং His-NT2RepCT এর সলিউশনগুলি রাতারাতি 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে জেল করা হয়েছিল।তারপর হাইড্রোজেলকে 20 মিলিমিটার ট্রিস-এইচসিএল (পিএইচ 8) দিয়ে 12.5 মিলিগ্রাম/মিলি ঘনত্বে পাতলা করা হয়েছিল, ভালভাবে ঝাঁকানো হয়েছিল এবং জেলটি ভাঙার জন্য পাইপেটেড করা হয়েছিল।এরপরে, হাইড্রোজেলকে 20 মিমি ট্রিস-এইচসিএল (পিএইচ 8) দিয়ে 10 বার পাতলা করা হয়েছিল, নমুনার 5 μl ফর্মভার দিয়ে প্রলিপ্ত একটি তামার গ্রিডে প্রয়োগ করা হয়েছিল এবং অতিরিক্ত নমুনাটি ব্লটিং পেপার দিয়ে সরানো হয়েছিল।নমুনাগুলিকে 5 μl মিলিকিউ জল দিয়ে দুবার ধুয়ে 5 মিনিটের জন্য 1% ইউরানাইল ফর্মেট দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল।শোষক কাগজ দিয়ে অতিরিক্ত দাগ সরান, তারপর বাতাসে জাল শুকিয়ে দিন।100 kV তে পরিচালিত FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ব্যবহার করে এই গ্রিডে ইমেজিং করা হয়েছিল।Veleta 2k × 2k CCD ক্যামেরা (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany) ব্যবহার করে ছবিগুলি x 26,500 এবং x 43,000 ম্যাগনিফিকেশনে রেকর্ড করা হয়েছে।প্রতিটি নমুনার জন্য (n = 1), 10-15টি চিত্র রেকর্ড করা হয়েছিল।ImageJ (https://imagej.nih.gov/) চিত্র বিশ্লেষণ এবং ফাইবার ব্যাস পরিমাপের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল (n = 100, বিভিন্ন ফাইবার)।প্রিজম 9 পেয়ার ছাড়া টি-টেস্ট (দুই-টেইলড) সঞ্চালনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।গড় His-NT2RepCT এবং NT fibrils যথাক্রমে 11.43 (SD 2.035) এবং 7.67 (SD 1.389) nm ছিল।আত্মবিশ্বাসের ব্যবধান (95%) -4.246 থেকে -3.275।স্বাধীনতার ডিগ্রি = 198, p <0.0001।
80 µl তরল নমুনা যাতে 10 µM থিওফ্লাভিন T (ThT) থাকে তা কর্নিং 96-ওয়েল ব্ল্যাক বটম ক্লিয়ার বটম প্লেট (কর্নিং গ্লাস 3881, ইউএসএ) ব্যবহার করে স্ট্যাটিক অবস্থার অধীনে ট্রিপ্লিকেট (n = 3) পরিমাপ করা হয়েছিল।ফ্লুরোসেন্স পার্থক্যগুলি একটি 440 এনএম উত্তেজনা ফিল্টার এবং একটি 480 এনএম নির্গমন ফিল্টার (বিএমজি ল্যাবটেক, অফেনবার্গ, জার্মানি থেকে ফ্লুওস্টার গ্যালাক্সি) ব্যবহার করে রেকর্ড করা হয়েছিল।ThT সংকেতটি স্যাচুরেটেড বা নিভানো হয়নি, কারণ সংকেতের তীব্রতা পরিবর্তন না করেই ThT-এর বিভিন্ন ঘনত্ব নিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল।ধোঁয়া পরিমাপের জন্য 360 এনএম এ রেকর্ড শোষণ।বীজ বপনের পরীক্ষা-নিরীক্ষার জন্য, 100 mg/mL জেলগুলি 37° C. তাপমাত্রায় তৈরি করা হয়েছিল, পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং 5%, 10% এবং 20% এর মোলার অনুপাতের বীজ বপনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।প্রিজম 9 ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
His-NT2RepCT এবং NT>100 mg/mL এর স্টক বরফের উপর গলিয়ে নিন এবং 0.22 µm ফিল্টারের মাধ্যমে ফিল্টার করুন।ন্যানোড্রপ ব্যবহার করে 280 এনএম-এ শোষণ পরিমাপ করে ঘনত্ব গণনা করা হয়েছিল।একটি 96-ওয়েল কালো নন-বাইন্ডিং প্লেট (কর্নিং) এর কূপগুলিতে একটি পরিষ্কার নীচে, নমুনাগুলি 20 মিলিগ্রাম/মিলিতে 20 মিলিমিটার ট্রিস-এইচসিএল pH 8 এ মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 5 μM ThT (চূড়ান্ত ঘনত্ব), মোট নমুনার ঘনত্বের সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল। 50 μl ভলিউম।একটি সেলঅবসার্ভার (জিস) মাইক্রোস্কোপে প্রতি 10 মিনিটে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ট্রান্সমিটেড লাইট চ্যানেল এবং এফআইটিসি উত্তেজনা এবং ThT ইমেজিংয়ের জন্য নির্গমন ফিল্টার সেট সহ নমুনাগুলি চিত্রিত করা হয়েছিল।একটি 20x/0.4 লেন্স ইমেজ করার জন্য ব্যবহার করা হয়।জেন ব্লু (জেইস) এবং ইমেজজে (https://imagej.nih.gov/) চিত্র বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।জেলগুলিও NT এবং His-NT2RepCT সলিউশন থেকে 50 mg/mL এর ঘনত্বে প্রস্তুত করা হয়েছিল যাতে 20 mM Tris pH 8 এবং 5 µM ThT থাকে এবং 90 মিনিটের জন্য 37 ° C তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়।জেলের টুকরোগুলি একটি নন-বাইন্ডিং কালো 96 ভাল পরিষ্কার নীচের প্লেটে 20 মিমি ট্রিস, পিএইচ 8 এবং 5 μM ThT ধারণকারী একটি নতুন কূপে স্থানান্তরিত হয়েছিল।20x/0.4 বিবর্ধনে সবুজ প্রতিপ্রভ এবং উজ্জ্বল ক্ষেত্রের চিত্রগুলি অর্জন করুন।ইমেজজে ইমেজ বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।
সমাধান NMR স্পেকট্রা একটি QCI Quadrupole রেজোন্যান্স পালসড গ্রেডিয়েন্ট ফিল্ড ক্রায়োপ্রোব (HFCN) দিয়ে সজ্জিত একটি 600 MHz ব্রুকার অ্যাভান্স নিও স্পেকট্রোমিটারে 310 K এ প্রাপ্ত হয়েছিল।13C, 15N লেবেলযুক্ত 10 mg/mL সমজাতীয় প্রোটিন ধারণকারী NMR নমুনা, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) এ দ্রবীভূত .pH 6.7-এ NT2RepCT-এর রাসায়নিক পরিবর্তনগুলি 15N-HSQC-এর 2D স্পেকট্রামে সর্বোচ্চ 23 বরাদ্দ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।
ম্যাজিক অ্যাঙ্গেল স্পিনিং সলিড NMR (MAS) স্পেকট্রা 13C, 15N-লেবেলযুক্ত হাইড্রোজেলগুলি একটি 3.2 মিমি 13C/15N{1H} ইলেকট্রনলেস প্রোবের সাথে সজ্জিত 800 MHz এ ব্রুকার অ্যাভান্স III HD স্পেকট্রোমিটারে রেকর্ড করা হয়েছিল।নমুনা তাপমাত্রা 277 K-এ পরিবর্তনশীল তাপমাত্রার গ্যাস প্রবাহ ব্যবহার করে নিয়ন্ত্রণ করা হয়েছিল। দ্বি-মাত্রিক ডাইপোল রোটেশনাল রেজোন্যান্স (DARR)76 এবং রেডিও ফ্রিকোয়েন্সি রিকনেকশন (RFDR)77 স্পেকট্রা যথাক্রমে 12.5 kHz এবং 20 kHz এর MAS ফ্রিকোয়েন্সিতে অর্জিত হয়েছিল।1H থেকে 13C পর্যন্ত ক্রস পোলারাইজেশন (CP) 1H এ 60.0 থেকে 48.0 kHz, 13C তে 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS এ) এবং যোগাযোগের সময় 0.5–1 ms একটি রৈখিক র‌্যাম্প ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।ডেটা সংগ্রহের সময় 73.5 kHz এ স্পাইনাল 6478 ডিকপলিং ব্যবহার করা হয়েছিল।অধিগ্রহণের সময় ছিল 10 মিলিসেকেন্ড এবং চক্র বিলম্ব ছিল 2.5 সেকেন্ড।RFDR বর্ণালীতে পরিলক্ষিত একক-লিঙ্কযুক্ত Cα/Cβ পারস্পরিক সম্পর্কগুলি DARR বর্ণালীতে বৈশিষ্ট্যযুক্ত অবশিষ্টাংশ-প্রকার রাসায়নিক স্থানান্তর এবং গুণিত-লিঙ্কযুক্ত পারস্পরিক সম্পর্কগুলির উপর ভিত্তি করে বরাদ্দ করা হয়েছিল।
Zipper79 ডাটাবেস (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp, এবং NTMiSp-এর জন্য ফ্লটার প্রবণতা এবং রোসেটা শক্তি মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।জিপার ডাটাবেস Rosetta Energy80 কম্পিউট করে, যা প্রোটিন গঠনের মডেল এবং বিশ্লেষণ করার জন্য বিভিন্ন মুক্ত শক্তি ফাংশনকে একত্রিত করে।-23 kcal/mol বা তার কম শক্তির মাত্রা ফাইব্রিলেটের উচ্চ প্রবণতা নির্দেশ করে।নিম্ন শক্তি মানে জিপার কনফর্মেশনে দুটি β-স্ট্র্যান্ডের আরও স্থিতিশীলতা।এছাড়াও, ওয়াল্টজ অ্যালগরিদমটি এনটি, এনটিএফএলএসপি এবং এনটিএমআইএসপি রেফের অ্যামাইলয়েডোজেনিক অঞ্চলগুলির পূর্বাভাস দিতে ব্যবহৃত হয়েছিল।81. (https://waltz.switchlab.org/)।
এনটি প্রোটিন দ্রবণটি পিএইচ 5.5 এবং 6.0 এ 2-(এন-মরফোলিনো) ইথানেসালফোনিক অ্যাসিড (এমইএস) বাফারের সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল যাতে পিএইচ কমিয়ে পিএইচ 6 এবং 7 করা হয়।চূড়ান্ত প্রোটিন ঘনত্ব ছিল 100 মিলিগ্রাম/মিলি।
J-1500 CD স্পেকট্রোমিটারে (JASCO, USA) 0.1 সেমি অপটিক্যাল পাথ সহ 300 μL কুভেট ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।20 মিমি ফসফেট বাফারে (pH 8) প্রোটিনগুলি 10 μM (n = 1) এ পাতলা করা হয়েছিল।লবণের উপস্থিতিতে প্রোটিনের স্থায়িত্ব বিশ্লেষণ করার জন্য, প্রোটিনগুলি যথাক্রমে 154 mM NaF বা NaCl ধারণকারী 20 মিমি ফসফেট বাফার (pH 8) এ একই ঘনত্বে (n = 1) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।25°C থেকে 95°C পর্যন্ত তাপমাত্রা স্ক্যানগুলি 222 nm-এ 1°C/মিনিট গরম করার হারে রেকর্ড করা হয়েছিল।স্থানীয়ভাবে ভাঁজ করা প্রোটিনের অনুপাত সূত্র (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।এছাড়াও, প্রতিটি নমুনার জন্য 260 এনএম থেকে 190 এনএম পর্যন্ত 25 ডিগ্রি সেলসিয়াসে এবং 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে গরম করার পরে পাঁচটি স্পেকট্রা রেকর্ড করা হয়েছিল।পাঁচটি বর্ণালী গড়, মসৃণ এবং মোলার উপবৃত্তায় রূপান্তরিত হয়েছিল।প্রিজম 9 ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
হিস-এনটি-জিএফপি (300 mg/mL, 80 µL) এর ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতা স্থির অবস্থার অধীনে একটি কালো স্বচ্ছ নীচে (কর্নিং গ্লাস 3881, USA) সহ 96-ওয়েল কর্নিং প্লেটে ট্রিপ্লিকেট (n = 3) পরিমাপ করা হয়েছিল।395 এনএম উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য সহ একটি ফ্লুরোসেন্স-ভিত্তিক প্লেট রিডার দিয়ে নমুনাগুলি পরিমাপ করুন এবং জেলেশনের আগে 509 এনএম এবং 2 ঘন্টা পরে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে নির্গমন রেকর্ড করুন।প্রিজম 9 দিয়ে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
পিউরিন নিউক্লিওসাইড ফসফোরাইলেজ অ্যাকটিভিটি অ্যাসে কিট (ফ্লুরোমেট্রিক পদ্ধতি, সিগমা অ্যালড্রিচ) প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ব্যবহার করা হয়েছিল।His-NT-PNP ধারণকারী জেল এবং সমাধানগুলির কার্যকলাপ পরিমাপ করতে, 10 ng His-NT-PNP এর সাথে 100 mg/mL NT এর মোট ভলিউম 2 μL মিশ্রিত করুন কারণ জেল সেটের সনাক্তকরণ ব্যবধানের উপরে একটি সংকেত দিয়েছে।হিস-এনটি-পিএনপি ছাড়া জেল এবং সমাধানগুলির জন্য নিয়ন্ত্রণ অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল।পরিমাপ দুবার করা হয়েছিল (n = 2)।ক্রিয়াকলাপটি পরিমাপ করার পরে, প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি সরানো হয়েছিল এবং পরিমাপের সময় জেলটি অক্ষত রয়েছে তা নিশ্চিত করার জন্য জেলটি ফটোগ্রাফ করা হয়েছিল।প্রিজম 9 ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
অধ্যয়নের নকশা সম্পর্কে আরও তথ্যের জন্য, এই নিবন্ধের সাথে সংযুক্ত প্রকৃতি অধ্যয়ন বিমূর্ত দেখুন।
চিত্র 1 এবং 2 প্রাথমিক তথ্য উপস্থাপন করে।1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, এবং 6, পরিপূরক ডুমুর।3, সম্পূরক ডুমুর।5a, d, সম্পূরক ডুমুর।6 এবং সম্পূরক ডুমুর.8. এই গবেষণার ডেটা ডেটা Zenodo ডেটাবেস https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653-এ হোস্ট করা হয়েছে৷এই গবেষণায় প্রাপ্ত NMR ডেটা এন্ট্রি আইডি bmrbig36 এর অধীনে BMRBig সংগ্রহস্থলে পোস্ট করা হয়েছিল।GFP এবং PNP এর কাঠামো PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) থেকে নেওয়া হয়েছিল।
রাইজিং, এ. এবং জোহানসন, জে. কৃত্রিম মাকড়সা সিল্ক স্পিনিং।জাতীয় রাসায়নিক।জীববিজ্ঞান11, 309–315 (2015)।
Babb, PL et al.নেফিলা ক্ল্যাভিপস জিনোম মাকড়সার সিল্ক জিনের বৈচিত্র্য এবং তাদের জটিল অভিব্যক্তিকে তুলে ধরে।জাতীয় জেনেট।49, 895-903 (2017)।