347 12.7*1.24 মিমি স্টেইনলেস স্টীল কয়েলড টিউবিং, সিঙ্ক্রোনাস ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক ঘনীভবনের আণবিক প্রক্রিয়া এবং α-সিনুকলিন এবং টাউ এর জমাটবদ্ধতা

Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি সীমিত CSS সমর্থন সহ একটি ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করছেন।সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷উপরন্তু, চলমান সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়া সাইট দেখাই।
স্লাইডার প্রতি স্লাইডে তিনটি নিবন্ধ দেখাচ্ছে৷স্লাইডগুলির মধ্য দিয়ে যেতে পিছনে এবং পরবর্তী বোতামগুলি ব্যবহার করুন, অথবা প্রতিটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যাওয়ার জন্য শেষে স্লাইড কন্ট্রোলার বোতামগুলি ব্যবহার করুন৷

347 স্টেইনলেস স্টীল পাইপ স্পেসিফিকেশন

347 12.7*1.24 মিমি স্টেইনলেস স্টীল কয়েলড টিউবিং

বাইরের ব্যাস: 914.4 মিমি ওডি পর্যন্ত 6.00 মিমি ওডি, 24 ইঞ্চি পর্যন্ত মাপ উপলব্ধ এক্স-স্টক, ওডি সাইজ স্টিল টিউবগুলি এক্স-স্টক উপলব্ধ

SS 347 পাইপের বেধের পরিসর: 0.3 মিমি - 50 মিমি, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ইত্যাদি (0.5-12 মিমি) অথবা অ-নিয়মিত আকার প্রয়োজন অনুসারে তৈরি করা হবে

প্রকার: SS 347 বিজোড় পাইপ |SS 347 ERW পাইপ |SS 347 ঢালাই পাইপ |SS 347 ফেব্রিকেটেড পাইপ |SS 347 CDW টিউব, LSAW পাইপ / সীম-ওয়েল্ডেড / পুনরায় আঁকা

ফর্ম: SS 347 বৃত্তাকার পাইপ/ টিউব, SS 347 স্কয়ার পাইপ/ টিউব, SS 347 আয়তক্ষেত্রাকার পাইপ/ টিউব, SS 347 কয়েলড টিউব, SS 347 “U” আকৃতি, SS 347 প্যান কেক কয়েল, SS 347 হাইড্রাক্স

দৈর্ঘ্য: একক র্যান্ডম, ডাবল র্যান্ডম এবং প্রয়োজনীয় দৈর্ঘ্যের শেষ: প্লেইন এন্ড, বেভেলড এন্ড, ট্রেডেড

শেষ সুরক্ষা: প্লাস্টিক ক্যাপ |বাইরে ফিনিশ: 2B, No.4, No.1, No.8 স্টেইনলেস স্টিল পাইপের জন্য মিরর ফিনিশ, গ্রাহকের প্রয়োজনীয়তা অনুযায়ী ফিনিশ

ডেলিভারি শর্ত: অ্যানিলড এবং পিকল্ড, পালিশ, উজ্জ্বল অ্যানিলড, কোল্ড ড্রন

পরিদর্শন, পরীক্ষার রিপোর্ট: মিল টেস্ট সার্টিফিকেট, EN 10204 3.1, রাসায়নিক রিপোর্ট, যান্ত্রিক রিপোর্ট, PMI টেস্ট রিপোর্ট, ভিজ্যুয়াল পরিদর্শন রিপোর্ট, তৃতীয় পক্ষের পরিদর্শন রিপোর্ট, NABL অনুমোদিত ল্যাব রিপোর্ট, ধ্বংসাত্মক পরীক্ষার রিপোর্ট, অ ধ্বংসাত্মক পরীক্ষার রিপোর্ট

প্যাকিং: কাঠের বাক্সে প্যাক করা, প্লাস্টিকের ব্যাগ, স্টিলের স্ট্রিপ বান্ডিল করা, বা গ্রাহকদের অনুরোধ অনুযায়ী

বিশেষ: উপরে ব্যতীত মাপ এবং বিশেষ উল্লেখ অনুরোধে তৈরি করা যেতে পারে

SS 347 পাইপ সাইজ রেঞ্জ: 1/2 ইঞ্চি NB, OD থেকে 24 ইঞ্চি

ASTM A312 347: উচ্চ তাপমাত্রা এবং সাধারণ ক্ষয়কারী পরিষেবার জন্য বিজোড় এবং সোজা-সিম ঢালাই করা অস্টেনিটিক পাইপ।ঢালাইয়ের সময় ফিলার ধাতু অনুমোদিত নয়।

ASTM A358 347: ক্ষয়কারী এবং/অথবা উচ্চ তাপমাত্রা পরিষেবার জন্য বৈদ্যুতিক ফিউশন ঢালাই অস্টেনিটিক পাইপ।সাধারণত শুধুমাত্র 8 ইঞ্চি পর্যন্ত পাইপ এই স্পেসিফিকেশন উত্পাদিত হয়.ঢালাইয়ের সময় ফিলার ধাতু যোগ করার অনুমতি দেওয়া হয়।

ASTM A790 347: স্ট্রেস জারা ক্র্যাকিং প্রতিরোধের উপর একটি বিশেষ জোর দিয়ে সাধারণ ক্ষয়কারী পরিষেবার উদ্দেশ্যে বিজোড় এবং সোজা-সিম ঢালাই করা ফেরিটিক/অস্টেনিটিক (ডুপ্লেক্স) পাইপ।

ASTM A409 347: স্ট্রেইট-সিম বা স্পাইরাল-সিম ইলেকট্রিক ফিউশন ঢালাই করা বড় ব্যাসের অস্টেনিটিক লাইট-ওয়াল পাইপ 14” থেকে 30” আকারে ক্ষয়কারী এবং/অথবা উচ্চতার জন্য দেওয়াল Sch5S এবং Sch 10S সহ

ASTM A376 347: উচ্চ তাপমাত্রা অ্যাপ্লিকেশনের জন্য বিজোড় austenitic পাইপ.

ASTM A813 347: উচ্চ তাপমাত্রা এবং সাধারণ ক্ষয়কারী অ্যাপ্লিকেশনের জন্য একক-সীম, একক- বা ডবল-ওয়েল্ডেড অস্টেনিটিক পাইপ।

ASTM A814 347: উচ্চ তাপমাত্রা এবং সাধারণ ক্ষয়কারী পরিষেবার জন্য কোল্ড-ওয়ার্কড ওয়েল্ডেড অস্টেনিটিক পাইপ।

347H স্টেইনলেস স্টীল পাইপ রাসায়নিক রচনা

স্টেইনলেস স্টীল 347H পাইপ যান্ত্রিক বৈশিষ্ট্য

স্টেইনলেস স্টীল 347H পাইপ ভৌত বৈশিষ্ট্য

347H স্টেইনলেস স্টীল পাইপের জন্য সমতুল্য গ্রেড

অ্যামাইলয়েড আলফা-সিনুকলিন (αS) সমষ্টি পারকিনসন রোগ এবং অন্যান্য সিনুক্লিনোপ্যাথির একটি বৈশিষ্ট্য।সম্প্রতি, আল্জ্হেইমের রোগের সাথে সাধারণত যুক্ত টাউ প্রোটিন αS প্যাথলজির সাথে যুক্ত হয়েছে এবং αS-সমৃদ্ধ অন্তর্ভুক্তিতে সহ-স্থানীয়করণের জন্য পাওয়া গেছে, যদিও দুটি প্রোটিনের একত্রিতকরণের আণবিক প্রক্রিয়া অস্পষ্ট রয়ে গেছে।আমরা এখানে রিপোর্ট করি যে αS ফেজটি ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক জটিল ঘনীভবনের মাধ্যমে তরল ঘনীভূতে বিভক্ত হয় যেমন টাউ এর মতো ইতিবাচক চার্জযুক্ত পলিপেপটাইডের সাথে।পলিকেশনের জন্য αS-এর সখ্যতা এবং জমাট বাঁধার নেটওয়ার্কের ভ্যালেন্স হ্রাসের হারের উপর নির্ভর করে, জমাট দ্রুত জেলেশন বা সমন্বিত হয় যার পরে ধীর অ্যামাইলয়েড একত্রিত হয়।উন্নত বায়োফিজিকাল কৌশলগুলির একটি স্যুটকে একত্রিত করে, আমরা তরল-তরল αS/Tau ফেজ বিচ্ছেদকে চিহ্নিত করতে এবং তরল প্রোটিন কনডেনসেটে উভয় প্রোটিন সমন্বিত ভিন্নধর্মী সমষ্টি গঠনের দিকে পরিচালিত মূল কারণগুলি সনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছি।
ঝিল্লির অংশগুলি ছাড়াও, কোষে স্থানিক বিচ্ছেদ প্রোটিন-সমৃদ্ধ, তরল-সদৃশ ঘন দেহ গঠনের মাধ্যমে অর্জন করা যেতে পারে যাকে বায়োমোলিকুলার কনডেনসেট বা ফোঁটা বলা হয়, একটি প্রক্রিয়ার মাধ্যমে যা তরল-তরল ফেজ বিচ্ছেদ (LLPS) নামে পরিচিত।এই ফোঁটাগুলি মাল্টিভ্যালেন্ট টেম্পোরাল মিথস্ক্রিয়া দ্বারা গঠিত হয়, সাধারণত প্রোটিন বা প্রোটিন এবং আরএনএর মধ্যে, এবং প্রায় সমস্ত জীবন্ত ব্যবস্থায় বিভিন্ন ধরনের ফাংশন পরিবেশন করে।প্রচুর পরিমাণে এলএলপি-সক্ষম প্রোটিন কম জটিলতার ক্রম প্রদর্শন করে যা প্রকৃতিতে এবং বায়োমোলিকুলার কনডেনসেট গঠনে অত্যন্ত বিশৃঙ্খল 3,4,5।অসংখ্য পরীক্ষামূলক গবেষণায় প্রোটিনগুলির নমনীয়, প্রায়শই বিশৃঙ্খল এবং বহুমুখী প্রকৃতি প্রকাশ করা হয়েছে যা এই তরল-সদৃশ ঘনীভূতগুলি তৈরি করে, যদিও নির্দিষ্ট আণবিক নির্ধারক সম্পর্কে খুব কমই জানা যায় যেগুলি এই ঘনীভূতগুলির বৃদ্ধি এবং পরিপক্কতাকে নিয়ন্ত্রণ করে আরও কঠিনের মতো অবস্থা..
নতুন ডেটা এই অনুমানকে সমর্থন করে যে বিভ্রান্তিকর প্রোটিন-চালিত LLPS এবং কঠিন কাঠামোতে ফোঁটাগুলির রূপান্তর প্রাসঙ্গিক সেলুলার পথ হতে পারে যা অদ্রবণীয় বিষাক্ত সমষ্টির গঠনের দিকে পরিচালিত করে যা প্রায়শই অবক্ষয়জনিত রোগের বৈশিষ্ট্য।অনেক এলএলপিএস-সম্পর্কিত অভ্যন্তরীণভাবে বিকৃত প্রোটিন (আইডিপি), প্রায়শই উচ্চ চার্জযুক্ত এবং নমনীয়, অ্যামাইলয়েড একত্রিতকরণ প্রক্রিয়ার মাধ্যমে দীর্ঘকাল ধরে নিউরোডিজেনারেশনের সাথে যুক্ত।বিশেষ করে, বায়োমোলিকুলার IDP কনডেনসেট যেমন FUS7 বা TDP-438 বা বড় কম জটিলতার ডোমেন যেমন hnRNPA19 সহ প্রোটিনগুলিকে তরলকরণ নামক প্রক্রিয়ার মাধ্যমে জেলের মতো বা এমনকি কঠিন আকারে পরিণত হতে দেখা গেছে।যৌগসলিড ফেজ ট্রানজিশনে (LSPT) সময়ের একটি ফাংশন হিসাবে বা কিছু পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল পরিবর্তন বা প্যাথলজিক্যালি উল্লেখযোগ্য মিউটেশনের প্রতিক্রিয়া হিসাবে 1,7।
ভিভোতে এলএলপিএস-এর সাথে যুক্ত আরেকটি আইডিপি হল টাউ, একটি মাইক্রোটিউবুল-সম্পর্কিত ডিসঅর্ডারড প্রোটিন যার অ্যামাইলয়েড অ্যাগ্রিগেশন আলঝাইমার ডিজিজে জড়িত ছিল।অনুকূল ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক ইন্টারঅ্যাকশনের কারণে টাউকে স্বতঃস্ফূর্তভাবে দ্রবণ/সাইটোপ্লাজম থেকে বিচ্ছিন্ন হতে দেখা গেছে, যার ফলে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কোসার্ভেটস নামে পরিচিত টাউ-সমৃদ্ধ ফোঁটা তৈরি হয়।এটাও লক্ষ্য করা গেছে যে এই ধরনের অ-নির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়া প্রকৃতির অনেক বায়োমোলিকুলার কনডেনসেটের পিছনে চালিকা শক্তি।টাউ প্রোটিনের ক্ষেত্রে, ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক একত্রীকরণ সরল একত্রীকরণের মাধ্যমে গঠিত হতে পারে, যেখানে প্রোটিনের বিপরীতভাবে চার্জযুক্ত অঞ্চলগুলি বিভাজন প্রক্রিয়াকে ট্রিগার করে, বা RNA-এর মতো নেতিবাচক চার্জযুক্ত পলিমারগুলির সাথে মিথস্ক্রিয়া দ্বারা জটিল একত্রিতকরণের মাধ্যমে।
সম্প্রতি, α-synuclein (αS), PD এবং অন্যান্য নিউরোডিজেনারেটিভ রোগে জড়িত একটি অ্যামাইলয়েড IDP যা সম্মিলিতভাবে synucleinopathy17,18 নামে পরিচিত, সেলুলার এবং প্রাণী মডেলে 19,20 প্রোটিন কনডেনসেটে ঘনীভূত তরল-জাতীয় আচরণের সাথে প্রদর্শিত হয়েছে।ইন ভিট্রো গবেষণায় দেখা গেছে যে αS প্রধানত হাইড্রোফোবিক মিথস্ক্রিয়াগুলির মাধ্যমে সাধারণ একত্রীকরণের মাধ্যমে এলএলপিএসের মধ্য দিয়ে যায়, যদিও এই প্রক্রিয়াটির জন্য ব্যতিক্রমীভাবে উচ্চ প্রোটিন ঘনত্ব এবং সাধারণত দীর্ঘ ইনকিউবেশন সময় প্রয়োজন হয় 19,21।ভিভোতে পর্যবেক্ষণ করা αS-ধারণকারী কনডেনসেটগুলি এটি বা অন্যান্য LLPS প্রক্রিয়া দ্বারা গঠিত কিনা তা একটি মূল অমীমাংসিত সমস্যা থেকে যায়।একইভাবে, যদিও PD এবং অন্যান্য সিনুক্লিনোপ্যাথির নিউরনে αS অ্যামাইলয়েড একত্রীকরণ পরিলক্ষিত হয়েছে, তবে সঠিক প্রক্রিয়া যার দ্বারা αS অন্তঃকোষীয় অ্যামাইলয়েড একত্রিতকরণের মধ্য দিয়ে যায় তা অস্পষ্ট থেকে যায়, কারণ এই প্রোটিনের অত্যধিক এক্সপ্রেশন এই প্রক্রিয়াটিকে নিজে থেকেই ট্রিগার করে বলে মনে হয় না।অতিরিক্ত সেলুলার ক্ষতি প্রায়ই প্রয়োজন হয়, এটি পরামর্শ দেয় যে অন্তঃকোষীয় αS অ্যামাইলয়েড সমাবেশগুলির পুনর্নবীকরণের জন্য নির্দিষ্ট সেলুলার অবস্থান বা মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট প্রয়োজন।একটি সেলুলার পরিবেশ যা বিশেষভাবে একত্রিত হওয়ার প্রবণতা প্রোটিন ঘনীভূত 23 এর অভ্যন্তর হতে পারে।
মজার ব্যাপার হল, αS এবং tau কে পারকিনসন রোগ এবং অন্যান্য সিনুক্লিনোপ্যাথি 24,25 এর সাথে মানুষের মধ্যে বৈশিষ্ট্যগত রোগের অন্তর্ভুক্তিতে সহ-স্থানীয়করণ করতে পাওয়া গেছে এবং পরীক্ষাগুলি 26,27 দুটি প্রোটিনের মধ্যে একটি সিনারজিস্টিক প্যাথলজিকাল সম্পর্ক রিপোর্ট করেছে যা একত্রিতকরণ αS এবং এর মধ্যে একটি সম্ভাব্য সম্পর্ক নির্দেশ করে। নিউরোডিজেনারেটিভ রোগে টাউ।অসুস্থতা.αS এবং tau ভিট্রো এবং ভিভো 28,29-এ একে অপরের একত্রিতকরণ এবং প্রচার করতে পাওয়া গেছে এবং এই দুটি প্রোটিনের সমন্বয়ে গঠিত ভিন্নধর্মী সমষ্টি সিনুক্লিনোপ্যাথি 30 রোগীদের মস্তিষ্কে পরিলক্ষিত হয়েছে।যাইহোক, αS এবং tau-এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়ার আণবিক ভিত্তি এবং এর সহ-সমষ্টির প্রক্রিয়া সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়।αS-এর অত্যন্ত নেতিবাচক চার্জযুক্ত সি-টার্মিনাল অঞ্চল এবং টাউ-এর কেন্দ্রীয় প্রোলাইন-সমৃদ্ধ অঞ্চলের মধ্যে একটি ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক আকর্ষণের মাধ্যমে টাউ-এর সাথে যোগাযোগ করার খবর পাওয়া গেছে, যা ইতিবাচক চার্জযুক্ত অবশিষ্টাংশেও সমৃদ্ধ।
এই গবেষণায়, আমরা দেখাই যে αS প্রকৃতপক্ষে টাউ প্রোটিনের উপস্থিতিতে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক জটিল ঘনীভবনের মাধ্যমে ফোঁটাগুলিতে বিচ্ছিন্ন হতে পারে, অন্যান্য ইতিবাচক চার্জযুক্ত পলিপেপটাইড যেমন পলি-এল-লাইসিন (pLK) এর সাথে এর মিথস্ক্রিয়ার বিপরীতে এবং এই প্রক্রিয়ায়।αS ড্রপলেট নেটওয়ার্কের জন্য একটি স্ক্যাফোল্ড অণু হিসাবে কাজ করে।আমরা ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক αS কোসার্ভেটগুলির পরিপক্কতার প্রক্রিয়ায় লক্ষণীয় পার্থক্য চিহ্নিত করেছি, যা কোসার্ভেট নেটওয়ার্কের সাথে জড়িত প্রোটিনের মিথস্ক্রিয়াটির ভ্যালেন্সি এবং শক্তির পার্থক্যের সাথে সম্পর্কিত।মজার বিষয় হল, আমরা দীর্ঘস্থায়ী তরল কোসার্ভেটে αS এবং tau amyloid প্রোটিনের সহ-একত্রীকরণ পর্যবেক্ষণ করেছি এবং কিছু মূল কারণ চিহ্নিত করেছি যা এই ধরনের কোসার্ভেটে এই দুটি প্রোটিনের সহ-একত্রীকরণের দিকে পরিচালিত করে।এখানে আমরা এই প্রক্রিয়াটি বিশদভাবে বর্ণনা করি, যা রোগ-নির্দিষ্ট অন্তর্ভুক্তিতে দুটি প্রোটিনের সমষ্টিকরণের অন্তর্নিহিত একটি সম্ভাব্য আণবিক প্রক্রিয়া।
αS-এর নিরপেক্ষ pH (চিত্র 1a) এ একটি অত্যন্ত অ্যানিওনিক সি-টার্মিনাল লেজ রয়েছে, এবং আমরা অনুমান করেছি যে এটি পলিকেশনিক ডিসঅর্ডারড পলিপেপটাইড অণুর সাথে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কমপ্লেক্সের ঘনীভবনের মাধ্যমে এলএলপিএস হতে পারে।আমরা 100-অবশিষ্ট পলি-এল-লাইসিন (pLK) নিরপেক্ষ pH 32-এ ইতিবাচকভাবে চার্জযুক্ত এবং বিকৃত পলিমেরিক প্রকৃতির কারণে প্রারম্ভিক মডেল অণু হিসাবে ব্যবহার করেছি। প্রথমে, আমরা নিশ্চিত করেছি যে pLK সমাধান NMR স্পেকট্রোস্কোপির মাধ্যমে αS-এর Ct ডোমেনের সাথে যোগাযোগ করে। (চিত্র 1b) αS:pLK মোলার অনুপাত বৃদ্ধির উপস্থিতিতে 13C/15N-লেবেলযুক্ত αS ব্যবহার করে।αS-এর Ct-ডোমেনের সাথে pLK-এর মিথস্ক্রিয়া রাসায়নিক পরিবর্তনের বিশৃঙ্খলা এবং প্রোটিনের এই অঞ্চলে সর্বোচ্চ তীব্রতা হ্রাসের মধ্যে নিজেকে প্রকাশ করে।মজার ব্যাপার হল, যখন আমরা pLK এর সাথে αS মিশ্রিত করি প্রায় αS ঘনত্বে।পলিথিন গ্লাইকোলের উপস্থিতিতে 5–25 µM (5–15% PEG-8) (সাধারণ LLPS বাফার: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) আমরা অবিলম্বে প্রোটিন গঠনের বিস্তৃত ক্ষেত্রের মধ্য দিয়ে গেলাম .ফোঁটাগুলি ফ্লুরোসেন্স (WF) এবং উজ্জ্বল-ক্ষেত্র (BF) মাইক্রোস্কোপি (চিত্র 1c) ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।ঘনীভূত αS ধারণকারী 1-5 µm ফোঁটা (যোগ করা হয়েছে 1 µM AlexaFluor488-লেবেলযুক্ত αS, AF488-αS), তাদের ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক বৈশিষ্ট্যগুলি তাদের 10% 1,6-হেক্সানিডিওল (1,6-এইচডি) এবং এর সংবেদনশীলতা থেকে তাদের প্রতিরোধের থেকে প্রাপ্ত করা যেতে পারে। NaCl ঘনত্ব বৃদ্ধি (চিত্র 1c)।αS/pLK ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কমপ্লেক্সের কোসারভেটগুলির তরল-সদৃশ প্রকৃতি তাদের মিলিসেকেন্ডের মধ্যে ফিউজ করার ক্ষমতা দ্বারা প্রদর্শিত হয় (চিত্র 1d)।টার্বিডিমেট্রি ব্যবহার করে, আমরা এই অবস্থার অধীনে ফোঁটাগুলির গঠনের পরিমাণ নির্ধারণ করেছি, এর স্থায়িত্ব (চিত্র 1e) এর সাথে যুক্ত প্রধান মিথস্ক্রিয়াটির ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক প্রকৃতি নিশ্চিত করেছি এবং LLPS প্রক্রিয়ার উপর বিভিন্ন পলিমার অনুপাতের প্রভাব মূল্যায়ন করেছি (চিত্র 1f)।যদিও পলিমার অনুপাতের বিস্তৃত পরিসরে ফোঁটা গঠন পরিলক্ষিত হয়, পিএলকে αS-এর বেশি হলে প্রক্রিয়াটি খুবই অনুকূল।রাসায়নিকভাবে ভিন্ন ডিসপ্লেসিং এজেন্ট dextran-70 (70 kDa) ব্যবহার করে বা গ্লাস স্লাইড ড্রপ, বিভিন্ন উপকরণের মাইক্রোপ্লেট কূপ, এপেনডর্ফ বা কোয়ার্টজ কৈশিক সহ বিভিন্ন নমুনা বিন্যাস ব্যবহার করে এলএলপিগুলিও দেখা গেছে।
এই গবেষণায় ব্যবহৃত WT-αS এবং ΔCt-αS ভেরিয়েন্টে বিভিন্ন প্রোটিন অঞ্চলের একটি পরিকল্পিত উপস্থাপনা।অ্যামফিপ্যাথিক এন-টার্মিনাল ডোমেন, হাইড্রোফোবিক অ্যামাইলয়েড-ফর্মিং (এনএসি) অঞ্চল এবং নেতিবাচকভাবে চার্জযুক্ত সি-টার্মিনাল ডোমেন যথাক্রমে নীল, কমলা এবং লাল রঙে দেখানো হয়েছে।WT-αS-এর নেট চার্জ পার রেসিডুয়াল (NCPR) ম্যাপ দেখানো হয়েছে।b macromolecular clumps অনুপস্থিতিতে αS/pLK ইন্টারঅ্যাকশনের NMR বিশ্লেষণ।pLK ঘনত্ব বাড়লে (αS:pLK মোলার অনুপাত 1:0.5, 1:1.5, এবং 1:10 যথাক্রমে হালকা সবুজ, সবুজ এবং গাঢ় সবুজে দেখানো হয়)।c কোসার্ভেট αS/pLK (মোলার অনুপাত 1:10) 25 µM (1 µM AF488-লেবেলযুক্ত αS বা WF ইমেজিংয়ের জন্য Atto647N-লেবেলযুক্ত pLK) LLPS বাফারে (শীর্ষে) বা 500 mtobot বা বাঁদিকে 500 mtobot দিয়ে পরিপূরক। % 1,6-হেক্সানিডিওল (1,6-এইচডি; নীচে ডানদিকে)।স্কেল বার = 20 µm।d 25 μM ঘনত্বে αS/pLK (মোলার অনুপাত 1:10) এর BF ড্রপলেট ফিউশনের প্রতিনিধি মাইক্রোস্কোপিক ছবি;তীরগুলি 200 ms এর মধ্যে একটি নতুন ড্রপে (কমলা তীর) পৃথক ড্রপগুলি (লাল এবং হলুদ তীর) একত্রিত করার নির্দেশ করে)।স্কেল বার = 20 µm।e 500 mM NaCl বা 25 µM αS এ 10% 1,6-HD যোগ করার আগে এবং পরে LLPS বাফারে হালকা বিচ্ছুরণ (350 nm এ) αS/pLK সমষ্টি (N = 3 নমুনা প্রতিলিপি, গড় এবং মানক বিচ্যুতিও নির্দেশিত)।f BF চিত্র (শীর্ষ) এবং αS/pLK সমষ্টির 25 μM αS এ αS:pLK মোলার অনুপাত (N = 3 নমুনা প্রতিলিপি, গড় এবং মানক বিচ্যুতিও নির্দেশিত) এর সাথে আলো বিচ্ছুরণ বিশ্লেষণ (350 nm, নীচে)।স্কেল বার = 10 µm।একটি চিত্রের স্কেল বারটি একটি প্যানেলে সমস্ত চিত্রের স্কেল নির্দেশ করে।কাঁচা তথ্য কাঁচা ডেটা ফাইল আকারে প্রদান করা হয়.
αS/pLK ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কমপ্লেক্স ঘনীভবনের আমাদের পর্যবেক্ষণ এবং tau31 এর সাথে সরাসরি মিথস্ক্রিয়া মাধ্যমে tau/RNA ঘনীভূতের ক্লায়েন্ট অণু হিসাবে αS এর পূর্ববর্তী পর্যবেক্ষণের উপর ভিত্তি করে, আমরা অনুমান করেছি যে αS এবং tau RNA এর অনুপস্থিতিতে দ্রাবকের সাথে সহ-বিচ্ছিন্ন হতে পারে। ঘনীভবনইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কমপ্লেক্সের মাধ্যমে, এবং αS হল αS/Tau coacervates-এ স্ক্যাফোল্ড প্রোটিন (চিত্র 2e-এ টাউ চার্জ বন্টন দেখুন)।আমরা লক্ষ্য করেছি যে যখন 10 μM αS এবং 10 μM Tau441 (যথাক্রমে 1 μM AF488-αS এবং 1 μM Atto647N-Tau সমন্বিত) LLPS বাফারে একসাথে মিশ্রিত হয়েছিল, তখন তারা সহজেই উভয় প্রোটিন সমন্বিত প্রোটিন সমষ্টি তৈরি করেছিল, যেমনটি WF মাইক্রোস্কোপি দ্বারা দেখা গেছে।(চিত্র 2a)।ফোঁটাতে দুটি প্রোটিনের সমষ্টিকরণ কনফোকাল (সিএফ) মাইক্রোস্কোপি (পরিপূরক চিত্র 1a) দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল।অনুরূপ আচরণ পরিলক্ষিত হয়েছিল যখন ডেক্সট্রান-70 একটি সমষ্টি এজেন্ট হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 1c)।FITC-লেবেলযুক্ত PEG বা dextran ব্যবহার করে, আমরা দেখতে পেলাম যে উভয় ক্রাউডিং এজেন্টই নমুনা জুড়ে সমানভাবে বিতরণ করা হয়েছে, বিচ্ছিন্নতা বা সংস্থান দেখায় না (পরিপূরক চিত্র 1d)।বরং, এটি পরামর্শ দেয় যে এই সিস্টেমে তারা ম্যাক্রোমোলিকুলার ক্রাউডিং ইফেক্টের মাধ্যমে ফেজ বিচ্ছেদকে উন্নীত করে, যেহেতু পিইজি একটি অগ্রাধিকারমূলকভাবে স্থিতিশীল ক্রাউডিং এজেন্ট, যেমনটি অন্যান্য এলএলপি সিস্টেমে দেখা যায় 33,34।এই প্রোটিন-সমৃদ্ধ ফোঁটাগুলি NaCl (1 M) এর প্রতি সংবেদনশীল ছিল কিন্তু 1,6-HD (10% v/v) নয়, তাদের ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক বৈশিষ্ট্যগুলি নিশ্চিত করে (পরিপূরক চিত্র 2a, b)।তাদের তরল আচরণ BF মাইক্রোস্কোপি (চিত্র 2b) ব্যবহার করে মিলিসেকেন্ড মার্জিং ড্রপলেট ইভেন্টগুলি পর্যবেক্ষণ করে নিশ্চিত করা হয়েছিল।
এলএলপিএস বাফারে αS/Tau441-এর একটি কনফোকাল (CF) মাইক্রোস্কোপি চিত্র (প্রতিটি প্রোটিনের 10 μM, AF488-লেবেলযুক্ত αS-এর 0.5 μM এবং Atto647N-লেবেলযুক্ত Tau441)।b αS/Tau441 ড্রপলেট ফিউশন ইভেন্টের প্রতিনিধি ডিফারেনশিয়াল ইন্টারফারেন্স কনট্রাস্ট (DIC) চিত্র (প্রতিটি প্রোটিনের জন্য 10 μM)।50 µM αS এর অনুপস্থিতিতে (বামে) বা উপস্থিতি (ডানে) Tau441 LLPS (0–15 µM) এর আলো বিচ্ছুরণের (350 nm এ) উপর ভিত্তি করে ফেজ ডায়াগ্রাম।উষ্ণ রং আরও বিক্ষিপ্ততা নির্দেশ করে।d αS ঘনত্ব বৃদ্ধির সাথে αS/Tau441 LLPS নমুনার হালকা বিক্ষিপ্তকরণ (5 µM এ Tau441, N = 2–3 নমুনা পুনরাবৃত্তি যেমন নির্দেশিত হয়েছে)।e কিছু টাউ প্রোটিন ভেরিয়েন্ট এবং এই গবেষণায় ব্যবহৃত প্রোটিনের বিভিন্ন অঞ্চলের পরিকল্পিত উপস্থাপনা: নেতিবাচক চার্জযুক্ত এন-টার্মিনাল ডোমেন (লাল), প্রোলিন-সমৃদ্ধ অঞ্চল (নীল), মাইক্রোটিউবুল-বাইন্ডিং ডোমেন (এমটিবিডি, কমলাতে হাইলাইট করা হয়েছে), এবং amyloid-গঠন জোড়া সর্পিল.ফিলামেন্ট অঞ্চল (PHF) MTBD (ধূসর) এর মধ্যে অবস্থিত।Tau441 এর নেট চার্জ পার রেসিডিউ (NCPR) ম্যাপ দেখানো হয়েছে।f 1 µM AF488-লেবেলযুক্ত αS এবং Atto647N-লেবেলযুক্ত ΔNt- ব্যবহার করে, ΔNt-টাউ (শীর্ষ, 10 µM প্রতি প্রোটিন) বা K18 (প্রতি µM প্রতি প্রোটিন, 10 µM প্রতি প্রোটিনের উপস্থিতিতে 1 µM AF488-লেবেলযুক্ত αS বা ΔCt-αS ব্যবহার করে ) ) ) LLPS বা K18 বাফারে ঘনীভূত WF এর মাইক্রোগ্রাফ।একটি চিত্রের স্কেল বারগুলি একটি প্যানেলের সমস্ত চিত্রের স্কেল উপস্থাপন করে (প্যানেল a, b এবং f এর জন্য 20 µm)।প্যানেলের জন্য কাঁচা ডেটা c এবং d কাঁচা ডেটা ফাইল হিসাবে সরবরাহ করা হয়।
এই LLPS প্রক্রিয়ায় αS-এর ভূমিকা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা প্রথমে NaCl (চিত্র 2c) এর ক্রমবর্ধমান ঘনত্ব ব্যবহার করে নেফেলোমেট্রি দ্বারা ফোঁটা স্থিতিশীলতার উপর αS-এর প্রভাব তদন্ত করেছি।αS সমন্বিত নমুনাগুলিতে লবণের ঘনত্ব যত বেশি হবে, আলো বিচ্ছুরণের মান তত বেশি হবে (350 nm-এ), যা এই LLPS সিস্টেমে αS-এর স্থিতিশীল ভূমিকা নির্দেশ করে।অনুরূপ প্রভাব αS ঘনত্ব (এবং তাই αS:Tau441 অনুপাত) প্রায় বৃদ্ধি করে লক্ষ্য করা যায়।টাউ ঘনত্বের তুলনায় 10-গুণ বৃদ্ধি (5 µM) (চিত্র 2d)।কোসার্ভেটে αS হল একটি স্ক্যাফোল্ড প্রোটিন দেখানোর জন্য, আমরা LLPS-বিঘ্নিত টাউ মিউট্যান্টের আচরণ তদন্ত করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি, যেটিতে নেতিবাচক চার্জযুক্ত N-টার্মিনাল অঞ্চলের অভাব রয়েছে (অবশিষ্ট 1-150, চিত্র 2e দেখুন) যাকে ΔNt-Tau বলা হয়।WF মাইক্রোস্কোপি এবং নেফেলোমেট্রি নিশ্চিত করেছে যে ΔNt-টাউ নিজেই LLPS (চিত্র 2f এবং পরিপূরক চিত্র 2d) এর মধ্য দিয়ে যায়নি, যেমনটি পূর্বে 14 রিপোর্ট করা হয়েছিল। যাইহোক, যখন αS এই ছেঁটে যাওয়া টাউ বৈকল্পিকের বিচ্ছুরণ সমাধানে যোগ করা হয়েছিল, তখন LLPS প্রক্রিয়াটি সম্পূর্ণ হয়ে গিয়েছিল। অনুরূপ অবস্থা এবং প্রোটিন ঘনত্বের অধীনে Tau এবং αS-এর পূর্ণ-আকারের সমাধানগুলির ফোঁটা ঘনত্বের কাছাকাছি ফোঁটা ঘনত্বের সাথে পুনরুদ্ধার করা হয়।এই প্রক্রিয়াটি কম ম্যাক্রোমোলিকুলার ক্রাউডিং (পরিপূরক চিত্র 2c) অবস্থার অধীনেও লক্ষ্য করা যেতে পারে।সি-টার্মিনাল αS অঞ্চলের ভূমিকা, কিন্তু এর সম্পূর্ণ দৈর্ঘ্য নয়, এলএলপিএস প্রক্রিয়ায় একটি সি-টার্মিনাল ছেঁটে যাওয়া αS বৈকল্পিক ব্যবহার করে ফোঁটা গঠনের বাধা দ্বারা প্রদর্শিত হয়েছিল যার অবশিষ্টাংশ 104-140 (চিত্র 1a) নেই (ΔCt- αS) প্রোটিন (চিত্র 2f এবং পরিপূরক চিত্র 2d)।কনফোকাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি (পরিপূরক চিত্র 1b) দ্বারা αS এবং ΔNt-Tau-এর সমষ্টিকরণ নিশ্চিত করা হয়েছিল।
Tau441 এবং αS-এর মধ্যে LLPS মেকানিজমকে আরও পরীক্ষা করার জন্য, একটি অতিরিক্ত Tau ভেরিয়েন্ট ব্যবহার করা হয়েছিল, যেমন মাইক্রোটিউবুল-বাইন্ডিং ডোমেনে (MTBD) পেয়ারড হেলিকাল ফিলামেন্ট কোর (PHF) ফ্র্যাগমেন্ট, যেটিতে চারটি বৈশিষ্ট্যযুক্ত পুনরাবৃত্তি ডোমেন থাকে, যা সাধারণত পরিচিত। K18 খণ্ড হিসাবে (চিত্র 2e দেখুন)।এটি সম্প্রতি রিপোর্ট করা হয়েছে যে αS অগ্রাধিকারমূলকভাবে একটি প্রোলিন-সমৃদ্ধ ডোমেনে অবস্থিত একটি টাউ প্রোটিনের সাথে আবদ্ধ হয় যা মাইক্রোটিউবুল-বাইন্ডিং ডোমেনের আগে থাকে।যাইহোক, PHF অঞ্চলটি ইতিবাচক চার্জযুক্ত অবশিষ্টাংশে সমৃদ্ধ (চিত্র 2e দেখুন), বিশেষ করে লাইসিন (15% অবশিষ্টাংশ), যা আমাদের পরীক্ষা করতে প্ররোচিত করে যে এই অঞ্চলটি αS/Tau কমপ্লেক্সের ঘনীভবনেও অবদান রাখে কিনা।আমরা লক্ষ্য করেছি যে K18 একাই পরীক্ষিত অবস্থার অধীনে 100 μM পর্যন্ত ঘনত্বে LLPS ট্রিগার করতে পারে না (15% PEG বা 20% ডেক্সট্রান সহ LLPS বাফার) (চিত্র 2f)।যাইহোক, যখন আমরা 50 µM K18 এ 50 µM αS যোগ করি, তখন K18 এবং αS ধারণকারী প্রোটিন ফোঁটাগুলির দ্রুত গঠন নেফেলোমেট্রি (পরিপূরক চিত্র 2d) এবং WF মাইক্রোস্কোপি (চিত্র 2f) দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।প্রত্যাশিত হিসাবে, ΔCt-αS K18 (চিত্র 2f) এর LLPS আচরণ পুনরুদ্ধার করতে অক্ষম ছিল।আমরা লক্ষ্য করি যে αS/ΔNt-Tau বা αS/Tau441 এর তুলনায় αS/K18 একত্রিতকরণের জন্য সামান্য বেশি প্রোটিন ঘনত্বের প্রয়োজন হয় LLPS প্ররোচিত করার জন্য, অন্যান্য জিনিসগুলি সমান।এটি মাইক্রোটিউবুল-বাইন্ডিং ডোমেনের তুলনায় প্রোলিন-সমৃদ্ধ টাউ ডোমেনের সাথে αS সি-টার্মিনাল অঞ্চলের একটি শক্তিশালী মিথস্ক্রিয়া, যেমন পূর্বে বর্ণিত হয়েছে 31 এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।
প্রদত্ত যে ΔNt-Tau αS-এর অনুপস্থিতিতে LLPS সম্পাদন করতে পারে না, আমরা αS/Tau LLPS-কে পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের Tau (আইসোটাইপ, Tau441/Tau441) সহ এলএলপিএস সিস্টেমে এর সরলতা দেওয়ার জন্য একটি মডেল হিসাবে এই Tau রূপটিকে বেছে নিয়েছি।জটিল (হেটারোটাইপিক, αS/Tau441) একত্রীকরণ প্রক্রিয়া সহ।আমরা αS/Tau এবং αS/ΔNt-Tau সিস্টেমে সেন্ট্রিফিউগেশন এবং বিচ্ছুরিত ফেজ SDS-PAGE বিশ্লেষণ (দেখুন 2e) দ্বারা αS সমষ্টির ডিগ্রী (কনডেন্সড ফেজ প্রোটিনের অংশ হিসাবে, fαS,c) তুলনা করেছি, খুব অনুরূপ মান পাওয়া গেছে একই ঘনত্বে সমস্ত প্রোটিনের জন্য।বিশেষ করে, আমরা αS/Tau এবং αS/ΔNt-Tau-এর জন্য যথাক্রমে fαS,c 84 ± 2% এবং 79 ± 7% পেয়েছি, পরামর্শ দিয়েছি যে αS এবং tau-এর মধ্যে হেটেরোটাইপিক মিথস্ক্রিয়া টাউ অণুর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া থেকে উচ্চতর।মধ্যে
বিভিন্ন পলিকেশনের সাথে মিথস্ক্রিয়া এবং αS গতিবিদ্যার উপর ঘনীভবন প্রক্রিয়ার প্রভাব প্রথম ফটোব্লিচিং (FRAP) পদ্ধতির পরে ফ্লুরোসেন্স পুনরুদ্ধার দ্বারা অধ্যয়ন করা হয়েছিল।আমরা αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau এবং αS/pLK কোসার্ভেটস পরীক্ষা করেছি (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS এবং 100 μM Tau441 বা ΔNt-Tau বা 1 mM pLLK এর সাথে পরিপূরক)।নমুনা উপাদানগুলি মিশ্রিত করার পরে প্রথম 30 মিনিটের মধ্যে ডেটা প্রাপ্ত হয়েছিল।প্রতিনিধি FRAP চিত্র (চিত্র 3a, αS/Tau441 ঘনীভবন) এবং তাদের সংশ্লিষ্ট সময় কোর্স বক্ররেখা (চিত্র 3b, পরিপূরক চিত্র 3) থেকে এটি দেখা যায় যে αS গতিবিদ্যা Tau441 কোসার্ভেটগুলির সাথে খুব মিল।এবং ΔNt-Tau, যা pLK এর সাথে অনেক দ্রুত।এফআরএপি অনুসারে কোসার্ভেটের ভিতরে αS-এর জন্য গণনাকৃত প্রসারণ সহগ হল D = 0.013 ± 0.009 µm2/s এবং D = 0.026 ± 0.008 µm2/s αS/TauΔ-এর জন্য αS/Tα4 এর জন্য। αS/ সিস্টেম।pLK, Tau, এবং D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, যথাক্রমে (চিত্র 3c)।যাইহোক, বিচ্ছুরিত পর্বে ডিফিউশন সহগ αS সমস্ত ঘনীভূত পর্যায়গুলির চেয়ে অনেক বেশি মাত্রার, যেমন ফ্লুরোসেন্স কোরিলেশন স্পেকট্রোস্কোপি (FCS, পরিপূরক চিত্র 3 দেখুন) দ্বারা নির্ধারিত হয় একই অবস্থার অধীনে (LLPS বাফার) কিন্তু পলিকেশনের অনুপস্থিতিতে ( D = 8 ± 4 µm2/s)।অতএব, αS অনুবাদের গতিবিদ্যা উচ্চারিত আণবিক ক্রাউডিং প্রভাবের কারণে বিচ্ছুরিত পর্যায়ে প্রোটিনের তুলনায় কোসার্ভেটে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, যদিও সমস্ত কোসার্ভেটগুলি তাদের গঠনের পর প্রথম অর্ধ ঘন্টার মধ্যে তরল-সদৃশ বৈশিষ্ট্য বজায় রাখে, তাউ পর্বের বিপরীতে।পিএলকে কনডেনসেটে দ্রুত গতিবিদ্যা।
ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কোসার্ভেটে αS গতিবিদ্যার a–c FRAP বিশ্লেষণ (2% AF488-লেবেলযুক্ত αS)।তিন প্রতিলিপিতে αS/Tau441 FRAP অ্যাসেসের প্রতিনিধি চিত্রগুলি (a), যেখানে লাল বৃত্তগুলি বিবর্ণ এলাকাগুলি নির্দেশ করে।স্কেল বার 5 µm।b গড় FRAP বক্ররেখা এবং (c) 100 µM αS এবং Tau441 (লাল) বা ΔNt-টাউ (নীল) বা pLK (সবুজ) এর সমান ঘনত্ব ব্যবহার করে তিনটি পরীক্ষা থেকে 5-6 (N) বিভিন্ন ফোঁটার জন্য গণনাকৃত প্রসারণ সহগ (D) LLPS এর ঘনত্বের দশগুণ।FRAP বক্ররেখার আদর্শ বিচ্যুতি ছায়াযুক্ত রঙে দেখানো হয়েছে।তুলনা করার জন্য, বিচ্ছুরিত পর্যায়ে বিচ্ছুরণ সহগ αS ফ্লুরোসেন্স কোরিলেশন স্পেকট্রোস্কোপি (এফসিএস) ব্যবহার করে ত্রিপিকে নির্ধারণ করা হয়েছিল (আরো তথ্যের জন্য পরিপূরক চিত্র 3 এবং পদ্ধতিগুলি দেখুন)।d LLPS বাফারে 100 μM TEMPOL-122-αS এর অবিচ্ছিন্ন এক্স-ব্যান্ড ইপিআর স্পেকট্রা কোনো পলিকেশন (কালো) ছাড়াই বা 100 μM Tau441 (লাল) বা ΔNt-Tau (নীল) বা 1 mM pLK (সবুজ) এর উপস্থিতিতে।ইনসেটটি শক্তিশালী ফিল্ড লাইনগুলির একটি বিবর্ধিত দৃশ্য দেখায় যেখানে সবচেয়ে নাটকীয় পরিবর্তন ঘটে।e 50 μM TEMPOL-122-αS এর বাইন্ডিং কার্ভ LLPS এর অনুপস্থিতিতে বিভিন্ন পলিকেশন সহ (কোন PEG নেই)।স্বাভাবিক ইপিআর স্পেকট্রামের ব্যান্ড II (IIII/III) এর তুলনায় ব্যান্ড III-এর হ্রাসকৃত প্রশস্ততা Tau441 (লাল), ΔNt-Tau (নীল) এবং pLK (সবুজ) এর মোলার অনুপাতকে বৃদ্ধি করতে দেখানো হয়েছে।রঙিন রেখাগুলি প্রতিটি বক্ররেখায় n অভিন্ন এবং স্বাধীন বাইন্ডিং সাইটগুলির সাথে একটি রুক্ষ বাঁধাই মডেল ব্যবহার করে ডেটার সাথে মানানসই দেখায়।কাঁচা তথ্য কাঁচা ডেটা ফাইল আকারে প্রদান করা হয়.
একটি পরিপূরক হিসাবে, আমরা নির্দেশিত স্পিন লেবেলিং (SDSL) এবং অবিচ্ছিন্ন ইলেক্ট্রন প্যারাম্যাগনেটিক রেজোন্যান্স (CW-EPR) ব্যবহার করে বিভিন্ন কোসার্ভেটে αS এর গতিবিদ্যা তদন্ত করেছি।এই পদ্ধতিটি একটি বাস্তবসম্মত অবশিষ্ট রেজোলিউশন 36,37,38 সহ IDP-এর নমনীয়তা এবং গতিশীলতা রিপোর্ট করার ক্ষেত্রে খুব দরকারী বলে প্রমাণিত হয়েছে।এই লক্ষ্যে, আমরা একক Cys মিউট্যান্টগুলিতে সিস্টাইনের অবশিষ্টাংশ তৈরি করেছি এবং 4-হাইড্রক্সি-2,2,6,6-টেট্রামেথাইলপাইপেরিডাইন-এন-অক্সিল (TEMPOL) স্পিন প্রোব ব্যবহার করেছি।Maleimide ডেরিভেটিভস তাদের লেবেল.আরও নির্দিষ্টভাবে, আমরা 122 বা 24 αS (TEMPOL-122-αS এবং TEMPOL-24-αS) অবস্থানে TEMPOL প্রোব সন্নিবেশ করেছি।প্রথম ক্ষেত্রে, আমরা প্রোটিনের সি-টার্মিনাল অঞ্চলকে লক্ষ্য করি, যা পলিকেশনের সাথে মিথস্ক্রিয়ায় জড়িত।পরিবর্তে, অবস্থান 24 আমাদের কনডেনসেটে প্রোটিনের সামগ্রিক গতিবিদ্যা সম্পর্কে তথ্য দিতে পারে।উভয় ক্ষেত্রেই, বিচ্ছুরিত পর্যায়ের প্রোটিনগুলির জন্য প্রাপ্ত ইপিআর সংকেতগুলি দ্রুত চলমান অবস্থায় নাইট্রোক্সাইড র্যাডিকালগুলির সাথে মিলে যায়।টাউ বা পিএলকে (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 বা ΔNt-Tau 1:1 অনুপাতে বা pLK 1:10 অনুপাতে) উপস্থিতিতে ফেজ বিচ্ছেদের পরে, আপেক্ষিক সর্বোচ্চ তীব্রতার বৃদ্ধি পরিলক্ষিত হয়েছিল αS এর EPR বর্ণালী।ক্ষতির রেখাটি প্রশস্ত হয়েছে, যা ড্রপলেটে αS পুনরিয়েন্টেশন গতিবিদ্যাকে সূচিত করে পাতলা পর্যায়ে প্রোটিনের তুলনায় (চিত্র 3d, পরিপূরক চিত্র 4a)।এই পরিবর্তনগুলি 122 অবস্থানে আরও স্পষ্ট। অবস্থান 24-এ pLK-এর উপস্থিতি প্রোবের গতিবিদ্যাকে প্রভাবিত করেনি, অবস্থান 122-এ বর্ণালী রেখার আকৃতি উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়েছে (পরিপূরক চিত্র 4a)।যখন আমরা সাধারণত স্পিন-লেবেলযুক্ত IDP38,39 এর গতিবিদ্যা বর্ণনা করতে ব্যবহৃত আইসোট্রপিক মডেল (পরিপূরক চিত্র 5a) ব্যবহার করে দুটি αS/পলিকেশন সিস্টেমের 122 অবস্থানে স্পেকট্রা মডেল করার চেষ্টা করি, তখন আমরা পরীক্ষামূলক স্পেকট্রা পুনর্গঠন করতে পারিনি।.24 স্পিন বৈপরীত্যের অবস্থানের বর্ণালী সিমুলেশন (পরিপূরক চিত্র 5a)।এটি পরামর্শ দেয় যে পলিকেশনের উপস্থিতিতে αS-এর সি-টার্মিনাল অঞ্চলের স্পিন কনফিগারেশনের স্থানগুলিতে অগ্রাধিকারমূলক অবস্থান রয়েছে।পরীক্ষামূলক EPR অবস্থার অধীনে ঘনীভূত পর্যায়ে αS-এর ভগ্নাংশ বিবেচনা করার সময় (αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, এবং αS/pLK-এর জন্য যথাক্রমে 84 ± 2%, 79 ± 7%, এবং 47 ± 4% - পরিপূরক দেখুন তথ্য বিশ্লেষণ c এর চিত্র 2e), এটি দেখা যায় যে EPR পদ্ধতির দ্বারা সনাক্ত করা বিস্তৃতকরণ প্রধানত ঘনীভূত পর্যায়ে বিভিন্ন পলিকেশনের সাথে αS-এর সি-টার্মিনাল অঞ্চলের মিথস্ক্রিয়া প্রতিফলিত করে (TEMPOL-122 ব্যবহার করার সময় প্রধান পরিবর্তন- αS), এবং প্রোটিন ঘনীভবন নয়।অনুসন্ধানে মাইক্রোভিসকোসিটির বৃদ্ধি পরিলক্ষিত হয়।প্রত্যাশিত হিসাবে, LLPS ব্যতীত অন্যান্য পরিস্থিতিতে প্রোটিনের EPR বর্ণালী সম্পূর্ণরূপে পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল যখন মিশ্রণে 1 M NaCl যোগ করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 4b)।সামগ্রিকভাবে, আমাদের ডেটা পরামর্শ দেয় যে CW-EPR দ্বারা সনাক্ত করা পরিবর্তনগুলি মূলত ঘনীভূত পর্যায়ে বিভিন্ন পলিকেশনের সাথে αS-এর সি-টার্মিনাল অঞ্চলের মিথস্ক্রিয়াকে প্রতিফলিত করে এবং এই মিথস্ক্রিয়া টাউ-এর তুলনায় pLK-এর সাথে শক্তিশালী বলে মনে হয়।
কোসার্ভেটে প্রোটিন সম্পর্কে আরও কাঠামোগত তথ্য পাওয়ার জন্য, আমরা সমাধানে এনএমআর ব্যবহার করে এলএলপিএস সিস্টেম অধ্যয়ন করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি।যাইহোক, আমরা শুধুমাত্র বিচ্ছুরিত পর্যায়ে অবশিষ্ট αS ভগ্নাংশ সনাক্ত করতে পারি, যা কোসার্ভেটের ভিতরে প্রোটিন গতিশীলতা হ্রাস এবং এনএমআর বিশ্লেষণে সমাধানের নীচে একটি ঘন ফেজের কারণে হতে পারে।যখন আমরা NMR (পরিপূরক চিত্র 5c, d) ব্যবহার করে এলএলপিএস নমুনার বিচ্ছুরিত পর্যায়ে অবশিষ্ট প্রোটিনের গঠন এবং গতিশীলতা বিশ্লেষণ করেছি, তখন আমরা লক্ষ্য করেছি যে প্রোটিনটি pLK এবং ΔNt-টাউ উভয়ের উপস্থিতিতে প্রায় অভিন্ন আচরণ করেছে। যা প্রোটিন মেরুদণ্ডের গৌণ গঠন এবং গতিশীলতায় ছিল, গৌণ রাসায়নিক স্থানান্তর এবং R1ρ শিথিলকরণের উপর পরীক্ষা দ্বারা প্রকাশিত হয়েছে।এনএমআর ডেটা দেখায় যে αS-এর সি-টার্মিনাস পলিকেশনগুলির সাথে মিথস্ক্রিয়াগুলির কারণে বাকি প্রোটিন ক্রমগুলির মতো তার বিকৃত প্রকৃতি বজায় রাখার সময় গঠনমূলক নমনীয়তার উল্লেখযোগ্য ক্ষতির সম্মুখীন হয়।
যেহেতু TEMPOL-122-αS ঘনীভূত পর্যায়ে পরিলক্ষিত CW-EPR সংকেত বিস্তৃতি পলিকেশনের সাথে প্রোটিনের মিথস্ক্রিয়াকে প্রতিফলিত করে, তাই আমরা LLPS এর অনুপস্থিতিতে বিভিন্ন পলিকেশনের সাথে αS-এর আবদ্ধ সম্বন্ধ মূল্যায়ন করার জন্য একটি ইপিআর টাইট্রেশন করেছি (কোনও জমে নেই বাফার এলএলপিএস), পরামর্শ দেয় যে মিথস্ক্রিয়াগুলি পাতলা এবং ঘনীভূত পর্যায়গুলিতে একই রকম (যা আমাদের ডেটা দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছে, পরিপূরক চিত্র 4a এবং পরিপূরক চিত্র 6)।লক্ষ্য ছিল যে সমস্ত কোসার্ভেট, তাদের সাধারণ তরলের মতো বৈশিষ্ট্য থাকা সত্ত্বেও, আণবিক স্তরে অন্তর্নিহিত ডিফারেনশিয়াল আচরণ প্রদর্শন করে কিনা।প্রত্যাশিত হিসাবে, ইপিআর বর্ণালী ক্রমবর্ধমান পলিকেশন ঘনত্বের সাথে বিস্তৃত হয়েছে, যা প্রায় সম্পৃক্ততার দিকে সমস্ত মিথস্ক্রিয়া অংশীদারের আণবিক মিথস্ক্রিয়াগুলির কারণে আণবিক নমনীয়তা হ্রাসকে প্রতিফলিত করে (চিত্র 3e, পরিপূরক চিত্র। 6)।pLK ΔNt-Tau এবং Tau441 এর তুলনায় একটি নিম্ন মোলার অনুপাত (পলিকেশন:αS) এ এই স্যাচুরেশন অর্জন করেছে।প্রকৃতপক্ষে, n অভিন্ন এবং স্বাধীন বাইন্ডিং সাইট অনুমান করে একটি আনুমানিক বাঁধাই মডেলের সাথে ডেটার তুলনা দেখায় যে pLK (~5 μM) এর আপাত বিচ্ছিন্নতা ধ্রুবকটি Tau441 বা ΔNt-Tau (~50 μM) এর চেয়ে কম মাত্রার একটি ক্রম। )µM)।যদিও এটি একটি মোটামুটি অনুমান, এটি পরামর্শ দেয় যে ক্রমাগত ইতিবাচক চার্জ অঞ্চলগুলির সাথে সহজ পলিকেশনগুলির জন্য αS-এর উচ্চতর সখ্যতা রয়েছে।αS এবং বিভিন্ন পলিকেশনের মধ্যে সখ্যতার এই পার্থক্যের পরিপ্রেক্ষিতে, আমরা অনুমান করেছি যে তাদের তরল বৈশিষ্ট্যগুলি সময়ের সাথে সাথে ভিন্নভাবে পরিবর্তিত হতে পারে এবং এইভাবে বিভিন্ন LSPT প্রক্রিয়ায় ভোগে।
প্রোটিন কোসারভেটের মধ্যে অত্যন্ত ভিড়ের পরিবেশ এবং প্রোটিনের অ্যামাইলয়েড প্রকৃতির প্রেক্ষিতে, আমরা সম্ভাব্য LSPT প্রক্রিয়াগুলি সনাক্ত করতে সময়ের সাথে সাথে কোসারভেটের আচরণ পর্যবেক্ষণ করেছি।BF এবং CF মাইক্রোস্কোপি (চিত্র 4) ব্যবহার করে, আমরা লক্ষ্য করেছি যে αS/Tau441 দ্রবণে একটি বৃহৎ পরিমাণে সমন্বিত হয়, বড় ফোঁটা তৈরি করে যা কূপের নীচের অংশে পূর্ণ ফোঁটা হিসাবে স্লাইডের সাথে যোগাযোগ করে এবং ভিজিয়ে দেয়, প্রত্যাশা অনুযায়ী (পরিপূরক চিত্র 7d);আমরা এই নীচের-গঠিত কাঠামো "প্রোটিন ভেলা" বলি।এই কাঠামোগুলি তরল থেকে যায় কারণ তারা ফিউজ করার ক্ষমতা ধরে রেখেছিল (পরিপূরক চিত্র 7b) এবং এলএলপিএস ট্রিগার হওয়ার কয়েক ঘন্টা পরে দেখা যেতে পারে (চিত্র 4 এবং পরিপূরক চিত্র 7c)।আমরা লক্ষ্য করেছি যে ভারসাম্যহীন চার্জ এবং এইভাবে উচ্চ ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক পৃষ্ঠের সম্ভাব্যতা সহ ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কোসার্ভেটগুলির জন্য প্রত্যাশিত হাইড্রোফোবিক পদার্থের (পরিপূরক চিত্র 7a) পরিবর্তে হাইড্রোফিলিকের পৃষ্ঠে ভিজানোর প্রক্রিয়াটি অনুকূল।উল্লেখযোগ্যভাবে, αS/ΔNt-টাউ সমন্বিততা এবং রাফটিং উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, যখন αS/pLK ঘনীভূতগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 4)।সংক্ষিপ্ত ইনকিউবেশন সময়ের মধ্যে, αS/pLK ফোঁটাগুলি হাইড্রোফিলিক পৃষ্ঠকে একত্রিত করতে এবং ভেজাতে সক্ষম হয়েছিল, কিন্তু এই প্রক্রিয়াটি দ্রুত বন্ধ হয়ে যায় এবং 5 ঘন্টার ইনকিউবেশনের পরে, শুধুমাত্র সীমিত একত্রিত হওয়ার ঘটনা এবং কোন ভেজা পরিলক্ষিত হয়নি।- জেল-ড্রিপ ট্রানজিশন।
প্রতিনিধি BF (গ্রেস্কেল প্যানেল) এবং CF (ডান প্যানেল, সবুজ রঙে AF488-লেবেলযুক্ত αS) 100 μM αS (1% ফ্লুরোসেন্ট লেবেল) সম্বলিত কোসার্ভেট নমুনার উপস্থিতিতে LLPS বাফারে 100 µM মাইক্রো-টপ ইমেজ (Tau4141) - টাউ (মাঝে) বা 1 মিমি পিএলকে (নীচে) বিভিন্ন ইনকিউবেশন সময় এবং ফোকাল উচ্চতায় (জেড, প্লেটের নীচ থেকে দূরত্ব ভাল)।পরীক্ষাগুলি একই ফলাফলের সাথে একে অপরের থেকে স্বাধীনভাবে 4-6 বার পুনরাবৃত্তি হয়েছিল।αS/Tau441 কোসার্ভেটগুলি 24 ঘন্টা পরে ভিজে যায়, যা চিত্রের চেয়ে বড় ভেলা তৈরি করে।সমস্ত ছবির জন্য স্কেল বার হল 20 µm।
তারপরে আমরা জিজ্ঞাসা করেছি যে αS/Tau441 LLPS এ গঠিত বড় তরল জাতীয় প্রোটিন পুলগুলি অধ্যয়ন করা কোনও প্রোটিনের অ্যামাইলয়েড সমষ্টির দিকে পরিচালিত করবে কিনা।আমরা উপরের মতো একই অবস্থার অধীনে WF মাইক্রোস্কোপির সাথে সময়ের সাথে সাথে αS/Tau441 ফোঁটাগুলির পরিপক্কতা অনুসরণ করেছি, কিন্তু 1 μM AF488-লেবেলযুক্ত αS এবং Atto647N-লেবেলযুক্ত Tau441 (চিত্র 5a) ব্যবহার করে।প্রত্যাশিত হিসাবে, আমরা পরিপক্কতা প্রক্রিয়া জুড়ে সম্পূর্ণ প্রোটিন স্থানীয়করণ পর্যবেক্ষণ করেছি।মজার ব্যাপার হল, সিএ থেকে।5 ঘন্টা পরে, রাফ্টগুলির ভিতরে আরও তীব্র অ-বৃত্তাকার কাঠামো পরিলক্ষিত হয়, যেটিকে আমরা "পয়েন্ট" বলে থাকি, যার মধ্যে কিছুকে αS দিয়ে সমন্বিত করা হয়েছিল, এবং কিছু Tau441 (চিত্র 5a, সাদা তীর) এ সমৃদ্ধ হয়েছিল।αS/ΔNt-Tau-এর তুলনায় αS/ΔNt-Tau-এর জন্য এই দাগগুলি সর্বদা rafts-এর মধ্যে পরিলক্ষিত হয়েছে।পিএলকে এবং টাউ সিস্টেমের ফোঁটাগুলিতে কোনও স্বতন্ত্র দাগ ছিল না যা ফিউশন/ভেজানোর জন্য অযোগ্য।αS এবং Tau441 ধারণকারী এই দাগগুলি অ্যামাইলয়েড-এর মতো সমষ্টি কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা CF মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে একটি অনুরূপ পরীক্ষা করেছি যেখানে Tau441 Atto647N দিয়ে লেবেল করা হয়েছিল এবং 12.5 μM অ্যামাইলয়েড-নির্দিষ্ট থিওফ্লাভিন-টি (ThT) শুরু থেকে যুক্ত করা হয়েছিল।রঞ্জকযদিও αS/Tau441 ফোঁটা বা রাফ্টের ThT-দাগ 24 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পরেও পরিলক্ষিত হয়নি (চিত্র 5b, উপরের সারি—প্রোটিন রাফ্টের উপরে অবশিষ্ট ফোঁটা), রাফ্টের ভিতরে Atto647N-Tau441 ধারণকারী ThT-পজিটিভ কাঠামো খুবই দুর্বল ছিল।এটি পূর্বে বর্ণিত দাগের আকার, আকৃতি এবং অবস্থানের প্রতিলিপি করে (চিত্র 5বি, মাঝখানে এবং নীচের সারি), যে দাগগুলি বার্ধক্যজনিত তরল কোসার্ভেটে গঠিত অ্যামাইলয়েড-সদৃশ সমষ্টির সাথে মিলিত হতে পারে।
LLPS buffer সহ একটি মাইক্রোস্কোপ প্লেটের একটি কূপে 25 μM Tau441 (1 μM AF488-লেবেলযুক্ত αS এবং Atto647N-লেবেলযুক্ত Tau441) এর উপস্থিতিতে বিভিন্ন ইনকিউবেশন সময় এবং ফোকাল উচ্চতায় (z, সীমাহীন নিচ থেকে দূরত্ব) WF 25 μM αS) .অনুরূপ ফলাফল সহ ছয়টি পরীক্ষা স্বাধীনভাবে পুনরাবৃত্তি হয়েছিল।b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-লেবেলযুক্ত Tau441) এবং 12.5 μM থিওফ্লাভিন-টি (ThT) এর উপস্থিতিতে 25 μM αS-এর সিএফ মাইক্রোস্কোপিক চিত্র।ওজনযুক্ত প্রোটিন ফোঁটা এবং জমা করা প্রোটিন ভেলা এবং দাগগুলি যথাক্রমে উপরের এবং মধ্য সারিতে দেখানো হয়েছে।নীচের সারিটি 3টি স্বাধীন প্রতিলিপি থেকে ভেলা এবং ড্রপগুলির ছবি দেখায়।সাদা তীরগুলি উভয় প্যানেলে ThT- পজিটিভ বিন্দু নির্দেশ করে।সমস্ত ছবির জন্য স্কেল বার হল 20 µm।
তরল থেকে কঠিন রূপান্তরের সময় কোসার্ভেট প্রোটিন নেটওয়ার্কের পরিবর্তনগুলি আরও বিশদভাবে পরীক্ষা করার জন্য, আমরা ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইম ইমেজিং (FLIM) এবং Förster রেজোন্যান্স এনার্জি ট্রান্সফার মাইক্রোস্কোপি (FRET) (চিত্র 6 এবং পরিপূরক চিত্র 8 এবং 9) ব্যবহার করেছি।আমরা অনুমান করেছিলাম যে স্তরটির কোসার্ভেট পরিপক্কতা আরও ঘনীভূত বা এমনকি কঠিন-সদৃশ সমষ্টিযুক্ত প্রোটিন কাঠামোতে প্রোটিন এবং এটির সাথে সংযুক্ত ফ্লুরোসেন্ট প্রোবের মধ্যে ঘনিষ্ঠ যোগাযোগের দিকে নিয়ে যায়, সম্ভাব্যভাবে একটি সংক্ষিপ্ত প্রোবের জীবনকাল (τ) তে উদ্ভাসিত একটি শমনকারী প্রভাব তৈরি করে। , পূর্বে বর্ণিত হিসাবে 40.41,42।উপরন্তু, ডবল লেবেলযুক্ত নমুনার জন্য (AF488 এবং Atto647N যথাক্রমে FRET দাতা এবং গ্রহণকারী রঞ্জক হিসাবে), τ-এর এই হ্রাসের সাথে কোসার্ভেট ঘনীভবন এবং LSPT-এর সময় FRET(E) দক্ষতা বৃদ্ধিও হতে পারে।আমরা LLPS αS/Tau441 এবং αS/ΔNt-Tau নমুনাগুলিতে সময়ের সাথে ভেলা এবং স্পট গঠন পর্যবেক্ষণ করেছি (LLPS বাফারের প্রতিটি প্রোটিনের 25 µM যার মধ্যে 1 µM AF488 লেবেলযুক্ত αS এবং/অথবা Atto647N লেবেলযুক্ত Tau441 বা ΔNt-Tau)।আমরা একটি সাধারণ প্রবণতা লক্ষ্য করেছি যে AF488 (τ488) এবং Atto647N (τ647N) প্রোবের ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইম কোসার্ভেটগুলি পরিপক্ক হওয়ার সাথে সাথে সামান্য হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 6 এবং পরিপূরক চিত্র। 8c)।মজার বিষয় হল, এই পরিবর্তনটি রাফ্টের মধ্যে বিন্দুগুলির জন্য উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করা হয়েছিল (চিত্র 6c), ইঙ্গিত করে যে বিন্দুগুলিতে আরও প্রোটিন ঘনীভূত হয়েছে।এর সমর্থনে, 24 ঘন্টা বয়সী αS/ΔNt-টাউ ফোঁটার জন্য ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইমে কোন উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন পরিলক্ষিত হয়নি (পরিপূরক চিত্র 8d), পরামর্শ দেয় যে ফোঁটা জেলেশন একটি প্রক্রিয়া যা দাগ থেকে আলাদা এবং এটি উল্লেখযোগ্য আণবিক পুনর্গঠনের সাথে নয়। coacervates মধ্যে.এটি লক্ষ করা উচিত যে αS-এ বিন্দুগুলির বিভিন্ন আকার এবং পরিবর্তনশীল বিষয়বস্তু রয়েছে, বিশেষ করে αS/Tau441 সিস্টেমের জন্য (পরিপূরক চিত্র 8e)।স্পট ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইমে হ্রাস তীব্রতা বৃদ্ধির সাথে ছিল, বিশেষ করে Atto647N লেবেলযুক্ত Tau441 (পরিপূরক চিত্র 8a), এবং αS/Tau441 এবং αS/ΔNt-Tau উভয় সিস্টেমের জন্য উচ্চতর FRET দক্ষতা, যা আরও পাঁচ ঘণ্টা ঘনীভূত হওয়ার ইঙ্গিত দেয়। ট্রিগার করার পরে, স্থির বিদ্যুতের ভিতরে প্রোটিনগুলি ঘনীভূত হয়।αS/ΔNt-Tau-এর সাথে তুলনা করে, আমরা αS/Tau441 দাগে নিম্ন τ647N এবং কিছুটা উচ্চতর τ488 মান লক্ষ্য করেছি, যার সাথে নিম্ন এবং আরও অসঙ্গতিপূর্ণ FRET মান রয়েছে।সম্ভবত, এটি এই সত্যের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে যে αS/Tau441 সিস্টেমে, পর্যবেক্ষিত এবং প্রত্যাশিত αS প্রাচুর্য সমষ্টিতে আরও ভিন্নধর্মী, প্রায়শই Tau-এর তুলনায় সাবস্টোইকিওমেট্রিক, যেহেতু Tau441 নিজেও LLPS এবং সমষ্টির মধ্য দিয়ে যেতে পারে (পরিপূরক চিত্র 8e) .যাইহোক, যখন Tau441 এবং αS উভয়ই উপস্থিত থাকে তখন ফোঁটা সমন্বিত হওয়ার মাত্রা, ভেলা গঠন এবং গুরুত্বপূর্ণভাবে, তরল-সদৃশ কোসার্ভেটের মধ্যে প্রোটিন একত্রিতকরণ সর্বাধিক হয়।
প্রতিটি প্রোটিনের 25 μM এ αS/Tau441 এবং αS/ΔNt-Tau-এর একটি লাইফটাইম ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি (FLIM) ছবি (1 μM AF488-লেবেলযুক্ত αS এবং 1 μM Atto647N-লেবেলযুক্ত Tau441 বা ΔNt-Tau LLPS buff)।কলামগুলি বিভিন্ন পরিপক্কতার সময়ে (30 মিনিট, 5 ঘন্টা এবং 24 ঘন্টা) এলএলপিএস নমুনার প্রতিনিধি চিত্রগুলি দেখায়।লাল ফ্রেমটি αS/Tau441 দাগ সমন্বিত অঞ্চল দেখায়।লাইফ স্প্যান রঙ বার হিসাবে দেখানো হয়.সমস্ত ছবির জন্য স্কেল বার = 20 µm।b নির্বাচিত এলাকার FLIM ছবি জুম-ইন করুন, প্যানেলের লাল বাক্সে দেখানো হয়েছে a৷লাইফ রেঞ্জগুলি প্যানেল a এর মতো একই রঙের স্কেল ব্যবহার করে দেখানো হয়েছে।স্কেল বার = 5 µm।গ হিস্টোগ্রাম AF488 (αS-এর সাথে সংযুক্ত) বা Atto647N (Tau-এর সাথে সংযুক্ত) বিভিন্ন প্রোটিন প্রজাতির (ড্রপলেট-D-, raft-R- এবং speckle-P) দেখানো FLIM চিত্রগুলিতে চিহ্নিত করা হয়েছে Tau441 এর জীবনকালের সময় বিতরণ এবং αS/ΔNt-Tau coacervate নমুনা (D এর জন্য N = 17-32 ROI, R এর জন্য 29-44 ROI, এবং পয়েন্টের জন্য 21-51 ROI)।গড় এবং মাঝারি মানগুলি যথাক্রমে বাক্সের ভিতরে হলুদ বর্গক্ষেত্র এবং কালো রেখা হিসাবে দেখানো হয়।বাক্সের নীচের এবং উপরের সীমাগুলি যথাক্রমে প্রথম এবং তৃতীয় চতুর্থাংশের প্রতিনিধিত্ব করে এবং 1.5-গুণ ইন্টারকোয়ার্টাইল রেঞ্জের (IQR) মধ্যে সর্বনিম্ন এবং সর্বোচ্চ মানগুলিকে হুইস্কার হিসাবে দেখানো হয়।আউটলিয়ারগুলিকে কালো হীরা হিসাবে দেখানো হয়েছে।ডিস্ট্রিবিউশনের জোড়ার মধ্যে পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য একটি দুটি-নমুনা টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল, অসম বৈচিত্র্য অনুমান করে।টু-টেইলড টি-টেস্ট পি-মানগুলি তুলনামূলক ডেটার প্রতিটি জোড়ার জন্য তারকাচিহ্নের সাথে দেখানো হয়েছে (* p-মান > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns অবহেলা নির্দেশ করে (p-মান > 0.05)।সঠিক p মানগুলি পরিপূরক সারণী 1 এ দেওয়া হয়েছে এবং মূল ডেটাগুলি কাঁচা ডেটা ফাইল হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে।
স্পেকেলস/সমষ্টিগুলির অ্যামাইলয়েড-সদৃশ প্রকৃতিকে আরও প্রদর্শন করার জন্য, আমরা (1 M) NaCl এর উচ্চ ঘনত্বের সাথে 24 ঘন্টার জন্য অবিচ্ছিন্ন কোসার্ভেট নমুনাগুলিকে চিকিত্সা করেছি, যার ফলে প্রোটিন কোসার্ভেটগুলি থেকে সমষ্টিকে পৃথক করা হয়েছিল।যখন পারমাণবিক শক্তি মাইক্রোস্কোপি (AFM) ব্যবহার করে বিচ্ছিন্ন সমষ্টি (অর্থাৎ, সমষ্টির একটি বিচ্ছুরিত দ্রবণ) পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল, তখন আমরা প্রায় 15 এনএম এর নিয়মিত উচ্চতা সহ একটি প্রধানত গোলাকার আকারবিদ্যা পর্যবেক্ষণ করেছি, যা উচ্চ লবণ ঘনত্বের অবস্থার সাথে যুক্ত হতে থাকে, অনুরূপ পৃষ্ঠে শক্তিশালী হাইড্রোফোবিক প্রভাবের কারণে সাধারণ অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিলের আচরণ (উল্লেখ্য যে ফাইব্রিলগুলির সাধারণত ~10 এনএম উচ্চতা থাকে) (পরিপূরক চিত্র 10a)।মজার বিষয় হল, যখন বিচ্ছিন্ন সমষ্টিগুলিকে একটি আদর্শ ThT ফ্লুরোসেন্স অ্যাসেতে ThT দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল, তখন আমরা ThT ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টাম ফলনের একটি নাটকীয় বৃদ্ধি লক্ষ্য করেছি, যখন রঞ্জকটি সাধারণ αS অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিলস (পরিপূরক F10b) এর সাথে রঞ্জিত করা হয়েছিল তখন দেখা যায় তার সাথে তুলনীয়। কোসার্ভেট এগ্রিগেটে অ্যামাইলয়েডের মতো গঠন থাকে।.প্রকৃতপক্ষে, সমষ্টিগুলি উচ্চ লবণের ঘনত্বের প্রতি সহনশীল ছিল কিন্তু 4 M guanidine ক্লোরাইডের (GdnHCl) প্রতি সংবেদনশীল, যেমন সাধারণ অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিলস (পরিপূরক চিত্র 10c)।
এরপরে, আমরা একক অণু ফ্লুরোসেন্স, নির্দিষ্ট ফ্লুরোসেন্স কোরিলেশন/ক্রস-কোরিলেশন স্পেকট্রোস্কোপি (FCS/FCCS), এবং দ্বি-রঙের কাকতালীয় সনাক্তকরণ (TCCD) এর বিস্ফোরণ বিশ্লেষণ ব্যবহার করে সমষ্টিগুলির গঠন বিশ্লেষণ করেছি।এই লক্ষ্যে, আমরা 1 μM AF488-লেবেলযুক্ত αS এবং 1 μM Atto647N-লেবেলযুক্ত Tau441 সহ αS এবং Tau441 (উভয় 25 μM) সমন্বিত 100 μl LLPS নমুনাগুলিতে 24 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পরে গঠিত সমষ্টিগুলিকে বিচ্ছিন্ন করেছি।এলএলপিএস এবং প্রোটিনের মধ্যে সম্ভাব্য ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া রোধ করতে একই PEG-মুক্ত বাফার এবং 1 M NaCl (একই বাফার কোসার্ভেট থেকে সমষ্টিকে পৃথক করতে ব্যবহৃত একই বাফার) ব্যবহার করে একটি মনোমোলিকুলার অবস্থায় বিচ্ছুরিত সমষ্টিগত দ্রবণকে পাতলা করুন।একটি একক অণুর সময়ের গতিপথের একটি উদাহরণ চিত্র 7a এ দেখা যেতে পারে।FCCS/FCS বিশ্লেষণ (ক্রস-সম্পর্ক, CC এবং অটোকোরিলেশন, AC) দেখিয়েছে যে αS এবং tau সমন্বিত সমষ্টিগুলি নমুনাগুলিতে প্রচুর ছিল (চিত্র 7b, বাম প্যানেলে CC বক্ররেখা দেখুন), এবং একটি অতিরিক্ত মোনোমেরিক প্রোটিন হিসাবে উদ্ভূত হয়েছিল তরল প্রক্রিয়ার ফলাফল (চিত্র 7b, বাম প্যানেলে AC বক্ররেখা দেখুন)।শুধুমাত্র মনোমেরিক প্রোটিন সমন্বিত নমুনা ব্যবহার করে একই সমাধান অবস্থার অধীনে সম্পাদিত নিয়ন্ত্রণ পরীক্ষায় কোন CC বক্ররেখা দেখা যায়নি এবং AC বক্ররেখাগুলি এক-কম্পোনেন্ট ডিফিউশন মডেলের (Eq. 4) সাথে ভালভাবে ফিট করে, যেখানে মনোমেরিক প্রোটিনের প্রত্যাশিত প্রসারণ সহগ থাকে (চিত্র 7b) ), ডান প্যানেল)।সমষ্টিগত কণার প্রসারণ সহগ 1 µm2/s এর কম, এবং মনোমেরিক প্রোটিনের প্রায় 1 µm2/s।50-100 µm/s;মানগুলি একই রকম সমাধানের শর্তে পৃথকভাবে সোনিকেটেড αS অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিলস এবং মনোমেরিক αS-এর জন্য পূর্বে প্রকাশিত মানের অনুরূপ।যখন আমরা TCCD বিস্ফোরণ বিশ্লেষণ (চিত্র 7c, শীর্ষ প্যানেল) দিয়ে সমষ্টিগুলি বিশ্লেষণ করেছি, তখন আমরা দেখতে পেয়েছি যে প্রতিটি বিচ্ছিন্ন সমষ্টিতে (αS/Tau heteroaggregate), প্রায় 60% শনাক্ত সমষ্টিতে αS এবং tau উভয়ই রয়েছে, প্রায় 30% শুধুমাত্র রয়েছে tau, প্রায় 10% αS শুধুমাত্র।αS/Tau heteroaggregates-এর Stoichiometric বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে বেশিরভাগ heteroaggregates টাউতে সমৃদ্ধ হয়েছে (0.5 এর নিচে stoichiometry, মোট প্রতি টাউ অণুর গড় সংখ্যা αS অণুর চেয়ে 4 গুণ বেশি), যা FLIM-এ পর্যবেক্ষণ করা আমাদের কাজের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। পরীক্ষা.FRET বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এই সমষ্টিতে উভয় প্রোটিন রয়েছে, যদিও এই ক্ষেত্রে প্রকৃত FRET মানগুলি খুব বেশি গুরুত্ব দেয় না, যেহেতু পরীক্ষায় ব্যবহৃত লেবেলবিহীন প্রোটিনের আধিক্যের কারণে প্রতিটি সমষ্টিতে ফ্লুরোফোরের বিতরণ এলোমেলো ছিল।মজার বিষয় হল, যখন আমরা 45,46 পরিপক্ক অ্যামাইলয়েড সমষ্টি-ঘাটতি টাউ বৈকল্পিক ব্যবহার করে একই বিশ্লেষণ সম্পাদন করি (পরিপূরক চিত্র 11a,b দেখুন), আমরা লক্ষ্য করেছি যে যদিও αS ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক সমষ্টি একই ছিল (পরিপূরক চিত্র 11c, d), কোসার্ভেটের মধ্যে সমষ্টি গঠনের ক্ষমতা ব্যাপকভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং FLIM সিটু পরীক্ষায় বেশ কয়েকটি দাগ সনাক্ত করেছে এবং বিচ্ছিন্ন সমষ্টি নমুনার জন্য দুর্বল ক্রস-সম্পর্ক বক্ররেখা পরিলক্ষিত হয়েছে।যাইহোক, অল্প সংখ্যক শনাক্ত করা সমষ্টির জন্য (Tau441-এর মাত্র এক দশমাংশ), আমরা লক্ষ্য করেছি যে প্রতিটি সমষ্টি এই Tau রূপের তুলনায় αS-এ সমৃদ্ধ হয়েছিল, প্রায় 50% শনাক্ত সমষ্টিতে শুধুমাত্র αS অণু রয়েছে, এবং αS অতিরিক্ত ছিল ভিন্ন ভিন্ন .Tau441 (চিত্র 6f) দ্বারা উত্পন্ন ভিন্নধর্মী সমষ্টির বিপরীতে সমষ্টি (পরিপূরক চিত্র 11e দেখুন)।এই পরীক্ষাগুলির ফলাফলগুলি দেখায় যে যদিও αS নিজেই coacervate এর মধ্যে tau এর সাথে জমা হতে সক্ষম, এই অবস্থার অধীনে টাউ নিউক্লিয়েশন আরও অনুকূল, এবং ফলস্বরূপ অ্যামাইলয়েড-সদৃশ সমষ্টিগুলি αS এবং tau-এর একটি ফর্ম হিসাবে কাজ করতে সক্ষম।যাইহোক, একবার একটি টাউ-সমৃদ্ধ কোর তৈরি হয়ে গেলে, αS এবং tau-এর মধ্যে হেটেরোটাইপিক মিথস্ক্রিয়াগুলি টাউ অণুর মধ্যে হোমোটাইপিক মিথস্ক্রিয়াগুলির চেয়ে সমষ্টিগতভাবে অনুকূল হয়;এছাড়াও আমরা তরল αS/tau coacervates-এ প্রোটিন নেটওয়ার্ক পর্যবেক্ষণ করি।
αS/Tau441 ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কোসার্ভেটে গঠিত বিচ্ছিন্ন সমষ্টির একক অণুর একটি প্রতিনিধি ফ্লুরোসেন্স টেম্পোরাল ট্রেস।αS/Tau441 কোঅ্যাগ্রিগেটগুলির সাথে সম্পর্কিত বিস্ফোরণগুলি তিনটি সনাক্তকরণ চ্যানেলে পরিলক্ষিত হয়েছিল (প্রত্যক্ষ উত্তেজনার পরে AF488 এবং Atto647N নির্গমন, নীল এবং লাল রেখা, পরোক্ষ উত্তেজনার পরে Atto647N নির্গমন), FRET, বেগুনি লাইন)।LLPS (বাম প্যানেল) থেকে প্রাপ্ত বিচ্ছিন্ন αS/Tau441 সমষ্টির একটি নমুনার এফসিএস/এফসিসিএস বিশ্লেষণ।AF488 এবং Atto647N-এর জন্য অটোকোরিলেশন (AC) বক্ররেখা যথাক্রমে নীল এবং লাল রঙে দেখানো হয়েছে এবং উভয় রঞ্জক সমষ্টির সাথে যুক্ত ক্রস-সম্পর্ক (CC) বক্ররেখা বেগুনি রঙে দেখানো হয়েছে।এসি বক্ররেখাগুলি লেবেলযুক্ত মনোমেরিক এবং সমষ্টিযুক্ত প্রোটিন প্রজাতির উপস্থিতি প্রতিফলিত করে, যখন সিসি বক্ররেখাগুলি কেবলমাত্র ডাবল-লেবেলযুক্ত সমষ্টিগুলির বিস্তার দেখায়।একই বিশ্লেষণ, কিন্তু বিচ্ছিন্ন দাগের মতো একই সমাধান অবস্থার অধীনে, শুধুমাত্র মনোমেরিক αS এবং Tau441 ধারণকারী নমুনাগুলি ডান প্যানেলে নিয়ন্ত্রণ হিসাবে দেখানো হয়েছে।c αS/Tau441 ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কোসার্ভেটে গঠিত বিচ্ছিন্ন সমষ্টিগুলির একক অণুর ফ্লুরোসেন্স ফ্ল্যাশ বিশ্লেষণ।চারটি ভিন্ন পুনরাবৃত্তি (N = 152) পাওয়া প্রতিটি সমষ্টির জন্য তথ্য তাদের স্টোইচিওমেট্রি, এস মান এবং FRET দক্ষতা (শীর্ষ প্যানেল, রঙ বার ঘটনা প্রতিফলিত করে) এর বিপরীতে প্লট করা হয়েছে।তিন ধরনের সমষ্টিকে আলাদা করা যায়: S~1 এবং FRET~0 সহ শুধুমাত্র αS-সমষ্টি, S~0 এবং FRET~1 সহ শুধুমাত্র Tau-সমষ্টি এবং মধ্যবর্তী S সহ ভিন্ন ভিন্ন Tau/αS সমষ্টি এবং পরিমাণের FRET অনুমান প্রতিটি ভিন্নধর্মী সমষ্টি (N = 100) সনাক্ত করা উভয় মার্কার প্রোটিন নীচের প্যানেলে দেখানো হয়েছে (রঙের স্কেল ঘটনাটি প্রতিফলিত করে)।কাঁচা তথ্য কাঁচা ডেটা ফাইল আকারে প্রদান করা হয়.
তরল প্রোটিনের পরিপক্কতা বা বার্ধক্য সময়ের সাথে সাথে জেলের মতো বা শক্ত কাঠামোতে ঘনীভূত হওয়া কনডেনসেট47 এর বিভিন্ন শারীরবৃত্তীয় ক্রিয়াকলাপের সাথে সাথে রোগের সাথে জড়িত বলে জানা গেছে, অ্যামাইলয়েড সমষ্টি 7, 48, 49 এর পূর্বের একটি অস্বাভাবিক প্রক্রিয়া হিসাবে। আমরা ফেজ বিচ্ছেদ এবং আচরণ বিস্তারিতভাবে অধ্যয়ন করি।কম মাইক্রোমোলার ঘনত্ব এবং শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক পরিস্থিতিতে একটি নিয়ন্ত্রিত পরিবেশে এলোমেলো পলিকেশনের উপস্থিতিতে LSPT αS (উল্লেখ্য যে αS-এর গণনাকৃত শারীরবৃত্তীয় ঘনত্ব হল >1 µM50), LPS-এর সাধারণ তাপগতিগতভাবে চালিত আচরণ অনুসরণ করে।আমরা দেখেছি যে αS, যা শারীরবৃত্তীয় pH-এ একটি অত্যন্ত নেতিবাচকভাবে চার্জযুক্ত সি-টার্মিনাল অঞ্চল ধারণ করে, ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক প্রক্রিয়ার মাধ্যমে pLK বা Tau-এর মতো অত্যন্ত ক্যাটানিক ডিজঅর্ডার পেপটাইডের উপস্থিতিতে LLPS-এর মাধ্যমে জলীয় দ্রবণে প্রোটিন-সমৃদ্ধ ফোঁটা তৈরি করতে সক্ষম। একত্রিত macromolecules উপস্থিতিতে জটিল ঘনীভবন.এই প্রক্রিয়াটির সেলুলার পরিবেশে প্রাসঙ্গিক প্রভাব থাকতে পারে যেখানে αS ভিট্রো এবং ভিভো 51,52,53,54 উভয় ক্ষেত্রেই এর রোগ-সম্পর্কিত সমষ্টির সাথে যুক্ত বিভিন্ন পলিকেশনিক অণুর মুখোমুখি হয়।
অনেক গবেষণায়, ফোঁটাগুলির মধ্যে প্রোটিন গতিবিদ্যাকে পরিপক্কতা প্রক্রিয়া 55,56 নির্ধারণের অন্যতম প্রধান কারণ হিসাবে বিবেচনা করা হয়েছে।ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক αS পলিকেশনের সাথে সমন্বিত হয়, পরিপক্কতা প্রক্রিয়া দৃশ্যত পলিকেশনের সাথে মিথস্ক্রিয়ার শক্তি, ভ্যালেন্স এবং এই মিথস্ক্রিয়াগুলির বহুবিধতার উপর নির্ভর করে।ভারসাম্য তত্ত্ব পরামর্শ দেয় যে দুটি তরল অবস্থার একটি ভারসাম্যপূর্ণ ল্যান্ডস্কেপ বায়োপলিমার সমৃদ্ধ একটি বড় ফোঁটার উপস্থিতি যা LLPS57,58 চালায়।ফোঁটা বৃদ্ধি Ostwald maturation59, coalescence60 বা বিচ্ছুরিত ফেজ61 এ বিনামূল্যে মনোমারের ব্যবহার দ্বারা অর্জন করা যেতে পারে।αS এবং Tau441, ΔNt-Tau বা pLK-এর জন্য, এই গবেষণায় ব্যবহৃত অবস্থার অধীনে বেশিরভাগ প্রোটিন ঘনীভূত ছিল।যাইহোক, যখন পূর্ণ-আকারের টাউ ফোঁটাগুলি পৃষ্ঠ ভেজাতে দ্রুত একত্রিত হয়, তখন ফোঁটা একত্রিত হওয়া এবং ভেজা ΔNt-Tau এবং pLK-এর জন্য কঠিন ছিল, যা এই দুটি সিস্টেমে তরল বৈশিষ্ট্যগুলির দ্রুত ক্ষতির পরামর্শ দেয়।আমাদের FLIM-FRET বিশ্লেষণ অনুসারে, বয়স্ক pLK এবং ΔNt-Tau ড্রপলেটগুলি মূল ফোঁটার মতো প্রোটিন একত্রিতকরণের (অনুরূপ ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইম) অনুরূপ ডিগ্রী দেখিয়েছে, যা প্রস্তাব করে যে মূল প্রোটিন নেটওয়ার্কটি আরও কঠোর হলেও ধরে রাখা হয়েছিল।
আমরা নিম্নলিখিত মডেলে আমাদের পরীক্ষামূলক ফলাফলকে যুক্তিযুক্ত করি (চিত্র 8)।প্রাথমিকভাবে অস্থায়ীভাবে গঠিত ফোঁটাগুলি প্রায়শই ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক ক্ষতিপূরণ ছাড়াই প্রোটিন নেটওয়ার্ক হয়, এবং এইভাবে চার্জ ভারসাম্যহীনতার ক্ষেত্র রয়েছে, বিশেষ করে ড্রপলেট ইন্টারফেসে, যার ফলে উচ্চ ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক পৃষ্ঠের সম্ভাবনা সহ ফোঁটা হয়।চার্জের ক্ষতিপূরণের জন্য (একটি ঘটনা যাকে সাধারণত ভ্যালেন্স হ্রাস বলা হয়) এবং ফোঁটাগুলির পৃষ্ঠের সম্ভাব্যতা হ্রাস করতে, ফোঁটাগুলি পাতলা পর্ব থেকে নতুন পলিপেপটাইড অন্তর্ভুক্ত করতে পারে, চার্জ-চার্জ মিথস্ক্রিয়াকে অনুকূল করার জন্য প্রোটিন নেটওয়ার্কগুলিকে পুনর্গঠিত করতে পারে এবং অন্যান্য ফোঁটার সাথে যোগাযোগ করতে পারে।উপরিভাগ (ভেজা) সহ।αS/pLK ড্রপলেটগুলি, তাদের সহজ প্রোটিন নেটওয়ার্কের কারণে (শুধুমাত্র αS এবং pLK-এর মধ্যে হেটেরোটাইপিক মিথস্ক্রিয়া) এবং প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়াগুলির জন্য বৃহত্তর সখ্যতার কারণে, কনডেনসেটের চার্জ আরও দ্রুত ভারসাম্য বজায় রাখতে সক্ষম বলে মনে হয়;প্রকৃতপক্ষে, আমরা αS/Tau-এর তুলনায় প্রাথমিকভাবে গঠিত αS/pLK কোসার্ভেটে দ্রুত প্রোটিন গতিবিদ্যা পর্যবেক্ষণ করেছি।ভ্যালেন্স হ্রাসের পরে, মিথস্ক্রিয়াগুলি কম ক্ষণস্থায়ী হয়ে যায় এবং ফোঁটাগুলি তাদের তরল বৈশিষ্ট্যগুলি হারিয়ে ফেলে এবং কম ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক পৃষ্ঠের সম্ভাবনা সহ জেলের মতো, অ-দাহ্য ফোঁটায় পরিণত হয় (এবং তাই পৃষ্ঠটি ভেজাতে অক্ষম)।বিপরীতে, αS/Tau ড্রপলেটগুলি আরও জটিল প্রোটিন নেটওয়ার্ক (হোমোটাইপিক এবং হেটেরোটাইপিক উভয় মিথস্ক্রিয়া সহ) এবং প্রোটিনের মিথস্ক্রিয়াগুলির দুর্বল প্রকৃতির কারণে ড্রপলেট চার্জ ব্যালেন্স অপ্টিমাইজ করার ক্ষেত্রে কম দক্ষ।এর ফলে ফোঁটা দেখা যায় যা দীর্ঘ সময়ের জন্য তরল আচরণ বজায় রাখে এবং একটি উচ্চ ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক পৃষ্ঠ সম্ভাবনা প্রদর্শন করে যা সমন্বিত এবং বৃদ্ধির মাধ্যমে (এইভাবে ফোঁটার পৃষ্ঠের ক্ষেত্রফল/ভলিউম অনুপাত কমিয়ে) এবং হাইড্রোফিলিক সারফেস কেম ভেজানোর মাধ্যমে হ্রাস করা হয়।এটি বড় ঘনীভূত প্রোটিন লাইব্রেরি তৈরি করে যা তরল বৈশিষ্ট্য বজায় রাখে কারণ প্রোটিন নেটওয়ার্কে চার্জ অপ্টিমাইজেশানের জন্য ক্রমাগত অনুসন্ধানের কারণে মিথস্ক্রিয়াগুলি খুব ক্ষণস্থায়ী থাকে।মজার বিষয় হল, Tau-এর এন-টার্মিনালভাবে ছেঁটে যাওয়া ফর্ম, যার মধ্যে কিছু প্রাকৃতিকভাবে ঘটছে আইসোফর্ম 62, মধ্যবর্তী আচরণ প্রদর্শন করে, কিছু αS-এর সাথে বার্ধক্য দীর্ঘজীবী জেলের মতো ফোঁটাতে পরিণত হয়, যখন অন্যরা বড় তরল ঘনীভূত হয়।αS ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কোসার্ভেটসের পরিপক্কতার এই দ্বৈততা সাম্প্রতিক LLPS তাত্ত্বিক এবং পরীক্ষামূলক গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যা কনডেনসেটের আকার এবং তরল বৈশিষ্ট্য নিয়ন্ত্রণের চাবিকাঠি হিসাবে কনডেনসেটে ভ্যালেন্স হ্রাস এবং ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক সিভিংয়ের মধ্যে একটি সম্পর্ক চিহ্নিত করেছে।প্রক্রিয়া 58.61।
এই স্কিমটি LLPS এবং LSPT এর মাধ্যমে αS এবং Tau441-এর জন্য পুটেটিভ অ্যামাইলয়েড একত্রীকরণ পথ দেখায়।অতিরিক্ত আয়ন-সমৃদ্ধ (লাল) এবং ক্যাটেশন-সমৃদ্ধ (নীল) অঞ্চলে, সন্তোষজনক ভ্যালেন্স সহ αS এবং টাউ ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কোসার্ভেটগুলির পৃষ্ঠের শক্তি কম থাকে এবং তাই কম সমন্বিত হয়, ফলে দ্রুত ফোঁটা বার্ধক্য হয়।একটি স্থিতিশীল অ-সংযোজিত জেল অবস্থা অর্জন করা হয়।.αS/pLK সিস্টেমের ক্ষেত্রে এই পরিস্থিতি খুবই অনুকূল কারণ এর উচ্চতর সখ্যতা এবং সহজ প্রোটিন-জোড়া মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্ক, যা একটি দ্রুত জেল-এর মতো পরিবর্তনের অনুমতি দেয়।বিপরীতে, অসন্তোষজনক ভ্যালেন্স সহ ফোঁটা এবং সেইজন্য, মিথস্ক্রিয়া করার জন্য উপলব্ধ প্রোটিন-চার্জযুক্ত অঞ্চলগুলি কোসারভেটের পক্ষে হাইড্রোফিলিক পৃষ্ঠকে ফিউজ করা এবং ভিজানো সহজ করে তোলে যাতে তার উচ্চ পৃষ্ঠের শক্তি হ্রাস পায়।এই পরিস্থিতি αS/Tau441 coacervates-এর জন্য বাঞ্ছনীয়, যাদের দুর্বল Tau-Tau এবং αS-Tau মিথস্ক্রিয়া সমন্বিত একটি বহুমুখী জটিল নেটওয়ার্ক রয়েছে।পরিবর্তে, বৃহত্তর কোসার্ভেটগুলি আরও সহজে তাদের তরলের মতো বৈশিষ্ট্যগুলি ধরে রাখবে, যা অন্যান্য প্রোটিন থেকে প্রোটিনের মিথস্ক্রিয়া ঘটতে দেয়।অবশেষে, অ্যামাইলয়েড ভিন্নধর্মী সমষ্টি যাতে αS এবং tau উভয়ই কোসার্ভেট ফ্লুইডের মধ্যে গঠন করে, যা অন্তর্ভুক্তির দেহে পাওয়া ব্যক্তিদের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে, যা নিউরোডিজেনারেটিভ রোগের বৈশিষ্ট্য।
αS/Tau441-এর পরিপক্কতার সময় তৈরি হওয়া বৃহৎ তরল-সদৃশ কাঠামোগুলি একটি অত্যন্ত ঘনবসতিপূর্ণ কিন্তু গতিশীল প্রোটিন পরিবেশের সাথে এবং অল্প পরিমাণে, αS/ΔNt-টাউ কোসার্ভেটগুলি প্রোটিন একত্রিতকরণের নিউক্লিয়েশনের জন্য আদর্শ জলাধার।আমরা প্রকৃতপক্ষে এই ধরণের প্রোটিন কোসার্ভেটে কঠিন প্রোটিন সমষ্টির গঠন পর্যবেক্ষণ করেছি, প্রায়শই αS এবং tau উভয়ই থাকে।আমরা দেখিয়েছি যে এই হেটারোঅ্যাগ্রিগেটগুলি অ-ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া দ্বারা স্থিতিশীল হয়, সাধারণ অ্যামাইলয়েড ফাইব্রিলের মতো একইভাবে অ্যামাইলয়েড-নির্দিষ্ট ThT রঞ্জকগুলিকে আবদ্ধ করতে সক্ষম হয় এবং প্রকৃতপক্ষে বিভিন্ন প্রভাবের প্রতি একই রকম প্রতিরোধ ক্ষমতা রয়েছে।এলএলপিএস দ্বারা গঠিত αS/tau সমষ্টিগুলিকে অ্যামাইলয়েডের মতো বৈশিষ্ট্য দেখানো হয়েছে।প্রকৃতপক্ষে, তরল ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক কোসার্ভেটের মধ্যে এই ভিন্নধর্মী αS সমষ্টির গঠনে অ্যামাইলয়েড সমষ্টিতে টাউ-এর ঘাটতির পরিপক্ক রূপটি উল্লেখযোগ্যভাবে প্রতিবন্ধী।αS/Tau441 সমষ্টির গঠন শুধুমাত্র coacervates এর ভিতরে পরিলক্ষিত হয়, যা তরল-সদৃশ বৈশিষ্ট্য ধরে রাখে, এবং কখনই, যদি coacervates/droplets জেল অবস্থায় না পৌঁছায়।পরবর্তী ক্ষেত্রে, ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়াগুলির বর্ধিত শক্তি এবং ফলস্বরূপ, প্রোটিন নেটওয়ার্কের অনমনীয়তা অ্যামাইলয়েড নিউক্লিয়েশনের জন্য প্রয়োজনীয় নতুন প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া স্থাপনের জন্য প্রোটিনের প্রয়োজনীয় গঠনমূলক পুনর্বিন্যাসকে বাধা দেয়।যাইহোক, এটি আরও নমনীয়, তরল-সদৃশ কোসার্ভেটে অর্জন করা যেতে পারে, যা আকারে বৃদ্ধির সাথে সাথে তরল থাকার সম্ভাবনা বেশি থাকে।
ঘনীভূত পর্যায়ের মধ্যে সমষ্টির গঠন যে ছোট ছোট ফোঁটাগুলির তুলনায় বৃহৎ αS/Tau ঘনীভূতগুলির মধ্যে বাঞ্ছনীয় যেগুলি দ্রুত জেল করে, ফোঁটা সমন্বিততা নিয়ন্ত্রণ করে এমন কারণগুলি চিহ্নিত করার প্রাসঙ্গিকতা তুলে ধরে।এইভাবে, শুধুমাত্র ফেজ বিভাজনের প্রবণতাই নয়, তবে রোগ প্রতিরোধের পাশাপাশি সঠিকভাবে কাজ করার জন্য কনডেনসেটের আকার নিয়ন্ত্রণ করতে হবে।58,61।আমাদের ফলাফলগুলি αS/Tau সিস্টেমের জন্য LLPS এবং LSPT এর মধ্যে ভারসাম্যের গুরুত্বও তুলে ধরে।যদিও ফোঁটা গঠন অ্যামাইলয়েড একত্রীকরণের বিরুদ্ধে রক্ষা করতে পারে স্যাচুরেশন অবস্থার অধীনে উপলব্ধ প্রোটিন মনোমারের পরিমাণ হ্রাস করে, যেমনটি অন্যান্য সিস্টেমে প্রস্তাব করা হয়েছে 63,64, উচ্চ ফোঁটা স্তরে ড্রপলেট ফিউশন ধীর গঠনমূলক পুনর্বিন্যাসের মাধ্যমে অভ্যন্তরীণ প্রোটিন একত্রিত হতে পারে।প্রোটিন নেটওয়ার্ক।.
সামগ্রিকভাবে, আমাদের ডেটা LSPT এর প্রসঙ্গে ড্রপ নেটওয়ার্কগুলিতে সমন্বিত ভ্যালেন্স এবং সন্তুষ্ট/অসন্তুষ্ট মিথস্ক্রিয়াগুলির প্রাসঙ্গিকতার উপর জোর দেয়।বিশেষ করে, আমরা দেখাই যে পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের αS/Tau441 কনডেনসেটগুলি দক্ষতার সাথে অ্যামাইলয়েড-সদৃশ হেটারোঅ্যাগ্রিগেট তৈরি করতে ফিউজ এবং নিউক্লিয়েট করতে সক্ষম হয় যা উভয় প্রোটিনকে অন্তর্ভুক্ত করে এবং আমাদের পরীক্ষামূলক ফলাফলের উপর ভিত্তি করে একটি আণবিক প্রক্রিয়া প্রস্তাব করে।αS/Tau ফ্লুইড কোসার্ভেটে দুটি প্রোটিনের সহ-সমষ্টি যা আমরা এখানে রিপোর্ট করেছি তা প্রকৃতপক্ষে অন্তর্ভুক্তিতে দুটি প্রোটিনের সহ-স্থানীয়করণের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে, যা এই রোগের বৈশিষ্ট্য এবং LLPS এবং LLPS এর মধ্যে সম্পর্ক বোঝার ক্ষেত্রে অবদান রাখতে পারে। অ্যামাইলয়েড একত্রিতকরণ, নিউরোডিজেনারেশনে উচ্চ চার্জযুক্ত IDP-এর পথ প্রশস্ত করে।
মনোমেরিক WT-αS, cysteine ​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) এবং ΔCt-αS রূপগুলি (Δ101-140) E. coli তে প্রকাশ করা হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত হিসাবে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল।5 মিমি ডিটিটি ডিসালফাইড বন্ড গঠন প্রতিরোধে αS সিস্টাইন মিউট্যান্টের পরিশোধনের সমস্ত ধাপে অন্তর্ভুক্ত ছিল।Tau441 isoform (Addgene #16316 থেকে প্রাপ্ত প্লাজমিড), ΔNt-Tau ভেরিয়েন্ট (Δ1-150, প্রাইমার দিয়ে IVA ক্লোনিং করে প্রাপ্ত CTTTAAGAAGGAGAGATACATGATCGCCCACCGCGG, CATATGTATCCTCTCTTCTTATAAGTTAA53, ΔTAAGTTAAant53) GGCTC5 প্রাইমার সহ) ই. কোলাই সংস্কৃতি ছিল 37°C এবং 180 rpm-এ OD600 = 0.6–0.7 পর্যন্ত বেড়েছে, এবং 37°C তাপমাত্রায় 3 ঘন্টার জন্য IPTG দিয়ে অভিব্যক্তি প্ররোচিত হয়েছিল।4 °C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 11,500 xg-এ কোষ সংগ্রহ করুন এবং 150 mM NaCl ধারণকারী স্যালাইন বাফার দিয়ে ধুয়ে ফেলুন।লাইসিস বাফারে পেলেটটি পুনরায় চালু করুন (20 মিলি প্রতি 1 এল এলবি: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine, 50μpe μ0ptinM)।sonication পদক্ষেপ 10 ডালের জন্য 80% এর প্রশস্ততা সহ বরফের উপর সঞ্চালিত হয়েছিল (1 মিনিট চালু, 1 মিনিট বন্ধ)।একটি আল্ট্রাসাউন্ডে 60 মিলিলিটার বেশি করবেন না।E. coli lysates 95° C.তে 20 মিনিটের জন্য উত্তপ্ত করা হয়, তারপর বরফের উপর ঠাণ্ডা করা হয় এবং 40 মিনিটের জন্য 127,000×g সেন্ট্রিফিউজ করা হয়।স্পষ্টীকৃত সুপারনাট্যান্ট একটি 3.5 kDa ঝিল্লিতে প্রয়োগ করা হয়েছিল (স্পেকট্রাম™ থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ইউকে) এবং ডায়ালাইসিস বাফারের 4 L (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 mT2 মিমি) এর বিপরীতে ডায়ালাইজ করা হয়েছিল। , PMSF 0.1 mM) 10 ঘন্টার জন্য।একটি 5 মিলি ক্যাটেশন এক্সচেঞ্জ কলাম (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ভারসাম্য বাফার (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PTM 0) এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল।Tau lysate একটি 0.22 μm PVDF ফিল্টারের মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং 1 মিলি/মিনিট প্রবাহ হারে কলামে ইনজেকশন করা হয়েছিল।ধীরে ধীরে ইলুশন করা হয়েছিল, টাউকে 15-30% ইলিউশন বাফার (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) দিয়ে নির্গত করা হয়েছিল।ভগ্নাংশগুলি SDS-PAGE দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, এবং Tau-এর প্রত্যাশিত আণবিক ওজন সহ একটি ব্যান্ড ধারণকারী যে কোনও ভগ্নাংশকে 10 kDa সেন্ট্রিফিউজ ফিল্টার ব্যবহার করে ঘনীভূত করা হয়েছিল এবং 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM এবং DTT m2 এর জন্য একটি বাফার দিয়ে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। চূড়ান্ত প্রোটিন ঘনত্ব ছিল 100 μM।প্রোটিন দ্রবণটি তারপরে একটি 0.22 μm PVDF ফিল্টারের মাধ্যমে পাস করা হয়েছিল, দ্রুত হিমায়িত করা হয়েছিল এবং -80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সংরক্ষণ করা হয়েছিল।প্রোটিন K18 অনুগ্রহ করে প্রফেসর আলবার্তো বফি দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল।SDS-PAGE এবং MALDI-TOF/TOF দ্বারা নিশ্চিতকৃত প্রস্তুতির বিশুদ্ধতা ছিল >95%।বিভিন্ন সিস্টাইনকে রাসায়নিকভাবে অ্যালেক্সাফ্লুর 488-মেলেইমাইড (AF488, থার্মোফিশার সায়েন্টিফিক, ওয়ালথাম, এমএ, ইউএসএ) বা টেম্পোল-মেলেইমাইড (টরন্টো রিসার্চ কেমিক্যালস, টরন্টো, কানাডা) দিয়ে লেবেল করা হয়েছিল।শোষণ এবং MALDI-TOF/TOF দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল।Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau এবং K18 একই পদ্ধতি অনুসরণ করে Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) ব্যবহার করে 191 এবং 322 অবস্থানে নেটিভ সিস্টাইন অবশিষ্টাংশের সাথে লেবেল করা হয়েছিল।αS এবং Tau441-এর জন্য অবশিষ্ট মানচিত্র প্রতি নেট চার্জ CIDER66 ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল।
সলিড পলি-এল-লাইসিন (সাপ্লায়ার থেকে NMR অনুযায়ী pLK DP 90-110, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) 10 মিমি HEPES, 100 মিমি NaCl, pH 7.4 থেকে 10 মিমি ঘনত্বে দ্রবীভূত করা হয়েছিল, প্রক্রিয়া 5 এর জন্য সোনিকেটেড একটি অতিস্বনক জল স্নান মিনিট এবং -20 ° C এ সংরক্ষণ করুন.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) এবং FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) হল জলে দ্রবণীয় এবং LLPS বাফারে ব্যাপকভাবে বিতরণ করা হয়।ডায়ালাইসিস দূষিত লবণ অপসারণ করে।তারপরে তাদের 0.22 μm ছিদ্রযুক্ত একটি সিরিঞ্জ ফিল্টারের মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং তাদের ঘনত্ব একটি প্রতিসরাঙ্ক মিটার (মেটলার টলেডো, কলম্বাস, ওহিও, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।এলএলপিএস নমুনাগুলি নিম্নোক্ত ক্রমে ঘরের তাপমাত্রায় প্রস্তুত করা হয়েছিল: বাফার এবং এক্সট্রুশন মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 1 মিমি ট্রিস (2-কারবক্সিইথাইল) ফসফাইন (টিসিইপি, কার্বোসিন্থ, কম্পটন, ইউকে), 1 মিমি 2,2,2,2- (ইথেন- 1, 2-ডাইলডিনিট্রিল) টেট্রাসেটিক অ্যাসিড (ইডিটিএ, কার্বক্সিন্থ) এবং 1% প্রোটেজ ইনহিবিটর (পিএমএসএফ 100 মিমি, বেনজিমাইড 1 মিমি, লিউপেপটিন 5 μM) এর মিশ্রণ।তারপর αS এবং ফিউজড পলিকেশন (বিকল্প pLK বা Tau) যোগ করা হয়।থিওফ্লাভিন-টি টাইম সিরিজ পরীক্ষা-নিরীক্ষার জন্য (ThT, Carbosynth, Compton, UK), মোট ThT ঘনত্ব αS ঘনত্বের অর্ধেক ব্যবহার করুন।নমুনাগুলি একজাত কিনা তা নিশ্চিত করতে আলতোভাবে কিন্তু পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করুন।প্রতিটি উপাদানের ঘনত্ব পরীক্ষা থেকে পরীক্ষায় পরিবর্তিত হয়, যেমন ফলাফল বিভাগে বর্ণিত হয়েছে।যখনই পরীক্ষার সময়কাল 4 ঘন্টা অতিক্রম করে তখনই Azide 0.02% (w/v) এর ঘনত্বে ব্যবহার করা হয়েছিল।এলএলপিএস নমুনা ব্যবহার করে সমস্ত বিশ্লেষণের জন্য, বিশ্লেষণের আগে মিশ্রণটিকে 5 মিনিটের জন্য ভারসাম্য বজায় রাখতে দিন।হালকা বিচ্ছুরণ বিশ্লেষণের জন্য, নন-বাইন্ডিং 96-ওয়েল মাইক্রোপ্লেটে (µClear®, কালো, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) 150 μl নমুনা লোড করা হয়েছিল এবং আঠালো ফিল্ম দিয়ে আবৃত করা হয়েছিল।ক্লারিওস্টার প্লেট রিডারে (বিএমজি ল্যাবটেক, ওর্টেনবার্গ, জার্মানি) সমাধানের কেন্দ্রে 350 এনএম-এ শোষণ পরিমাপ করে এলএলপিগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।পরীক্ষাগুলি 25 ডিগ্রি সেলসিয়াসে তিন প্রতিলিপিতে পরিচালিত হয়েছিল এবং ত্রুটিগুলি গড় থেকে আদর্শ বিচ্যুতি হিসাবে গণনা করা হয়েছিল।নমুনা সেন্ট্রিফিউগেশন এবং এসডিএস-পেজ জেল বিশ্লেষণের মাধ্যমে পাতলা পর্বটি পরিমাপ করা হয়েছিল এবং পাতলা এবং ঘনীভূত পর্যায়গুলিতে αS ভগ্নাংশটি বিভিন্ন এলএলপিএস সমাধানগুলিতে পরিমাপ করা হয়েছিল।1 μM AF488-লেবেলযুক্ত αS সমন্বিত একটি 100 μl LLPS নমুনা পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রণের মাধ্যমে প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং তারপরে 9600×g এ 30 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন করা হয়েছিল, তারপরে বর্ষণটি সাধারণত দৃশ্যমান ছিল।সুপারনাট্যান্টের শীর্ষ 50 μl SDS-PAGE জেল ব্যবহার করে প্রোটিনের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল।কেমিডক জেল ইমেজিং সিস্টেম (বায়ো-র্যাড ল্যাবরেটরিজ, হারকিউলিস, সিএ, ইউএসএ) ব্যবহার করে AF488 ফিল্টার দিয়ে জেলগুলি স্ক্যান করা হয়েছিল বা Coomassie দাগ দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং উপযুক্ত ফিল্টার দিয়ে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল।ফলস্বরূপ ব্যান্ডগুলি ইমেজজে সংস্করণ 1.53i (ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট অফ হেলথ, ইউএসএ) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।পরীক্ষাগুলি অনুরূপ ফলাফল সহ দুটি ভিন্ন পরীক্ষায় নকল করা হয়েছিল।
সাধারণত, 150 μl নমুনাগুলি নন-বাইন্ডিং 96-ওয়েল মাইক্রোপ্লেটগুলিতে প্রয়োগ করা হয়েছিল এবং একটি Leica DMI6000B ইনভার্টেড মাইক্রোস্কোপে (লাইকা মাইক্রোসিস্টেম, ওয়েটজলার, জার্মানি) ঘরের তাপমাত্রায় ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল।স্পট পরীক্ষার জন্য, µ-স্লাইড অ্যাঞ্জিওজেনেসিস প্লেট (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) বা 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ব্যবহার করা হয়েছিল।EL6000 হ্যালোজেন বা পারদ ধাতু হ্যালাইড ল্যাম্পগুলি আলোকসজ্জার উত্স হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল (যথাক্রমে BF/DIC এবং WF ইমেজিংয়ের জন্য)।WF মাইক্রোস্কোপির জন্য, একটি 40x বিবর্ধন বায়ু উদ্দেশ্য (লাইকা মাইক্রোসিস্টেম, জার্মানি) নমুনার উপর আলো ফোকাস করতে এবং এটি সংগ্রহ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।AF488 এবং ThT লেবেলযুক্ত নমুনার জন্য, স্ট্যান্ডার্ড GFP ফিল্টার সেট, উত্তেজনা এবং নির্গমন ব্যান্ডপাস ফিল্টার, যথাক্রমে, 460-500 nm এবং 512-542 nm ব্যান্ডপাস ফিল্টার এবং একটি 495 nm dichro সহ উত্তেজনা এবং নির্গমন ফিল্টার করুন।Atto647N লেবেলযুক্ত নমুনার জন্য, উত্তেজনা এবং নির্গমন ব্যান্ডপাস ফিল্টার 628–40 nm এবং 692–40 nm সহ Cy5 ফিল্টারের একটি আদর্শ সেট এবং একটি 660 nm ডাইক্রোইক মিরর ব্যবহার করা হয়েছিল।BF এবং DIC মাইক্রোস্কোপির জন্য, একই প্রতিফলিত আলো সংগ্রহের উদ্দেশ্য ব্যবহার করুন।সংগৃহীত আলো একটি Leica DFC7000 CCD ক্যামেরায় (Leica Microsystems, Germany) রেকর্ড করা হয়েছিল।এক্সপোজার সময় ছিল BF এবং DIC মাইক্রোস্কোপি ইমেজিংয়ের জন্য 50 ms এবং WF মাইক্রোস্কোপি ইমেজিংয়ের জন্য 20-100 ms।তুলনা করার জন্য, ThT-এর সাথে সমস্ত পরীক্ষার জন্য এক্সপোজার সময় ছিল 100 ms।ড্রপলেট কোলেসেন্স কল্পনা করার জন্য টাইম-ল্যাপস পরীক্ষা-নিরীক্ষা করা হয়েছিল, প্রতি 100 এমএস কয়েক মিনিটের জন্য ছবি সংগ্রহ করা হয়েছিল।ইমেজজে (এনআইএইচ, ইউএসএ) চিত্র বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল।পরীক্ষাগুলি অনুরূপ ফলাফল সহ তিন প্রতিলিপিতে পরিচালিত হয়েছিল।
সমষ্টিকরণ পরীক্ষা, FRAP এবং 3D পুনর্গঠনের জন্য, চিত্রগুলি একটি ZEN 2 নীল সংস্করণ ব্যবহার করে একটি Zeiss LSM 880 ইনভার্টেড কনফোকাল মাইক্রোস্কোপে অর্জিত হয়েছিল (কার্ল জেইস এজি, ওবারকোচেন, জার্মানি)।50 μl-এর নমুনাগুলি µ-স্লাইড অ্যাঞ্জিওজেনেসিস পেট্রি ডিশ (Ibidi GmbH, Gröfelfing, জার্মানি) এ প্রয়োগ করা হয়েছিল, একটি হাইড্রোফিলিক পলিমার (ibiTreat) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং একটি 63× তেল নিমজ্জন লক্ষ্যে মাউন্ট করা হয়েছিল (প্ল্যান-অ্যাপোক্রোম্যাট 63.14/আইএল × এনএ) ডিআইসি-তে)।ছবিগুলি 458 nm, 488 nm, এবং 633 nm আর্গন লেজার লাইন ব্যবহার করে 0.26 µm/পিক্সেলের রেজোলিউশন এবং 470–600 nm, 628nm, 628nm, 628n এর উত্তেজনা এবং নির্গমন সনাক্তকরণ উইন্ডোগুলির জন্য 8 µs/পিক্সেলের একটি এক্সপোজার সময় ব্যবহার করে অর্জিত হয়েছিল এবং 638–755 এনএম যথাক্রমে ThT, AF488 এবং Atto647N কল্পনা করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।FRAP পরীক্ষার জন্য, প্রতিটি নমুনার টাইম-ল্যাপস ফটোগ্রাফি প্রতি সেকেন্ডে 1 ফ্রেমে রেকর্ড করা হয়েছিল।পরীক্ষাগুলি অনুরূপ ফলাফল সহ ঘরের তাপমাত্রায় তিন প্রতিলিপিতে পরিচালিত হয়েছিল।সমস্ত ছবি জেন ​​2 নীল সংস্করণ সফ্টওয়্যার (কার্ল জেইস এজি, ওবারকোচেন, জার্মানি) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।অরিজিনপ্রো 9.1 ব্যবহার করে জেন 2 ব্যবহার করে চিত্রগুলি থেকে এফআরএপি বক্ররেখাগুলি স্বাভাবিক করা হয়েছে, প্লট করা হয়েছে এবং তীব্রতা/সময়ের ডেটাতে লাগানো হয়েছে।অধিগ্রহণ ব্লিচিং প্রভাবের জন্য একটি অতিরিক্ত সূচকীয় শব্দের সাথে আণবিক বিস্তারের জন্য অ্যাকাউন্টে পুনরুদ্ধার বক্ররেখাগুলি একটি মনো-সূচক মডেলে লাগানো হয়েছিল।আমরা তখন নামমাত্র ব্লিচিং ব্যাসার্ধ এবং কাং এট আল-এর সমীকরণের মতো পূর্বে নির্ধারিত পুনরুদ্ধারের অর্ধ-জীবন ব্যবহার করে D গণনা করেছি।5 35 দেখানো হয়েছে।
αS-এর একক সিস্টাইন ভেরিয়েন্টগুলি 24 (TEMPOL-24-αS) এবং 122 (TEMPOL-122-αS) অবস্থানে 4-হাইড্রক্সি-2,2,6,6-টেট্রামেথাইলপাইপেরিডিন-এন-অক্সিল (TEMPOL) দিয়ে সংশ্লেষিত হয়েছিল, যথাক্রমেস্পিন লেবেলিং ইপিআর পরীক্ষার জন্য, αS ঘনত্ব 100 μM এ সেট করা হয়েছিল এবং PEG ঘনত্ব ছিল 15% (w/v)।বিভিন্ন সমষ্টিগত অবস্থার জন্য, αS:pLK অনুপাত ছিল 1:10, যখন αS:ΔNt-Tau এবং αS:Tau441 অনুপাত 1:1 এ বজায় রাখা হয়েছিল।ভিড়ের অনুপস্থিতিতে বাঁধাই টাইট্রেশন পরীক্ষা-নিরীক্ষার জন্য, TEMPOL-122-αS 50 μM এ রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং পলিকেশনগুলি ক্রমবর্ধমান ঘনত্বে টাইট্রেট করা হয়েছিল, প্রতিটি শর্ত আলাদাভাবে প্রস্তুত করে।CW-EPR পরিমাপ একটি ব্রুকার ELEXSYS E580 X-ব্যান্ড স্পেকট্রোমিটার ব্যবহার করে করা হয়েছিল যা একটি ব্রুকার ER4118 SPT-N1 রেজোনেটর দ্বারা সজ্জিত যা ~9.7 GHz এর একটি মাইক্রোওয়েভ (SHF) ফ্রিকোয়েন্সিতে কাজ করে।তাপমাত্রা 25 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সেট করা হয়েছিল এবং একটি তরল নাইট্রোজেন ক্রায়োস্ট্যাট দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল।স্পেকট্রা 4 মেগাওয়াট শক্তি, 0.1 mT এর একটি মডুলেশন প্রশস্ততা এবং 100 kHz এর একটি মডুলেশন ফ্রিকোয়েন্সি এ অসম্পৃক্ত অবস্থার অধীনে প্রাপ্ত করা হয়েছিল।Tau441 বা ΔNt-Tau (মূল প্রোটিন সমাধানে উপস্থিত) ধারণকারী নমুনাগুলিতে হ্রাসকারী এজেন্টের অবশিষ্ট ঘনত্বের কারণে নমুনা এবং সম্ভাব্য স্পিন হ্রাসের মধ্যে স্পিন ঘনত্বের পার্থক্য এড়াতে বর্ণালী তীব্রতা স্বাভাবিক করা হয়েছিল।Matlab®67-এ বাস্তবায়িত Easyspin সফ্টওয়্যার (v. 6.0.0-dev.34) ব্যবহার করে সম্পাদিত EPR বর্ণালী মডেলিংয়ের ফলে g এর প্রদত্ত মানগুলি প্রাপ্ত হয়েছিল।ডেটা মডেল করতে এক/দুটি উপাদান আইসোট্রপিক মডেল ব্যবহার করা হয়েছিল।সমস্ত সংকেত স্বাভাবিক করার পরে, সংশ্লিষ্ট পরীক্ষামূলক বর্ণালী থেকে প্রতিটি সিমুলেশন বিয়োগ করে অবশিষ্টাংশগুলি গণনা করা হয়েছিল।বাইন্ডিং টাইট্রেশন বিশ্লেষণের জন্য, নরমালাইজড ইপিআর স্পেকট্রাম (IIII/III) এর দ্বিতীয় ব্যান্ডের সাথে তৃতীয় ব্যান্ডের আপেক্ষিক তীব্রতা αS-এ পলিকেশনের বাঁধন নিরীক্ষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।বিভাজন ধ্রুবক (Kd) অনুমান করার জন্য, ফলাফল বক্ররেখাটি একটি আনুমানিক মডেলে লাগানো হয়েছিল যা n অভিন্ন এবং স্বাধীন বাঁধাই সাইটগুলি ধরে নিয়েছিল৷
এনএমআর স্পেকট্রোস্কোপি পরীক্ষাগুলি একটি ব্রুকার নিও 800 মেগাহার্টজ (1এইচ) এনএমআর স্পেকট্রোমিটার ব্যবহার করে একটি ক্রায়োপ্রোব এবং জেড-গ্রেডিয়েন্ট দিয়ে সজ্জিত করা হয়েছিল।সমস্ত পরীক্ষা 130-207 µM αS এবং 10 মিমি HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4-এ অনুরূপ αS/ΔNt-Tau এবং pLK সমতুল্য ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল এবং 15 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সঞ্চালিত হয়েছিল।NMR দ্বারা LPS নিরীক্ষণ করতে, 10% PEG প্রাক-মিশ্রিত নমুনায় যোগ করা হয়েছিল।রাসায়নিক স্থানান্তর বিক্ষিপ্ততা প্লট (চিত্র 1b) গড় 1H এবং 15N রাসায়নিক স্থানান্তর দেখায়।αS 2D1H-15N HSQC স্পেকট্রা পূর্ববর্তী অ্যাসাইনমেন্টের (BMRB এন্ট্রি #25227) উপর ভিত্তি করে বরাদ্দ করা হয়েছিল এবং HNCA, HNCO এবং CBCAcoNH এর 3D স্পেকট্রা রেকর্ডিং এবং বিশ্লেষণ করে নিশ্চিত করা হয়েছিল।13Cα এবং 13Cβ রাসায়নিক স্থানান্তরগুলি বিশুদ্ধ র্যান্ডম কয়েল কনফর্মেশন 68 (পরিপূরক চিত্র 5c) এ αS রাসায়নিক পরিবর্তনের তুলনায় গৌণ কাঠামোর প্রবণতাগুলির সম্ভাব্য পরিবর্তনগুলি পরিমাপ করতে ΔNt-Tau বা pLK এর উপস্থিতিতে গণনা করা হয়েছিল।R1ρ হারগুলি 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, এবং 800 ms বিলম্ব সহ hsqctretf3gpsi পরীক্ষাগুলি রেকর্ড করে (ব্রুকার লাইব্রেরি থেকে প্রাপ্ত) পরিমাপ করা হয়েছিল এবং সূচকীয় ফাংশনগুলি বিভিন্ন সময়ে বিলম্বের শীর্ষে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল। R1ρ এবং এর পরীক্ষামূলক অনিশ্চয়তা নির্ধারণের সময়।
দুই রঙের সময়-সমাধানযুক্ত ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি পরীক্ষাগুলি একটি বাণিজ্যিক সময়-সমাধানকৃত MT200 ফ্লুরোসেন্স কনফোকাল মাইক্রোস্কোপে (পিকোকুয়ান্ট, বার্লিন, জার্মানি) একটি সময়-সম্পর্কিত একক ফোটন গণনা (TCSPC) ডিভাইসের সাথে সম্পাদিত হয়েছিল।লেজার ডায়োড হেড স্পন্দিত ইন্টারলিভড এক্সিটেশন (PIE) এর জন্য ব্যবহৃত হয়, রশ্মিটি একটি একক মোড ওয়েভগাইডের মধ্য দিয়ে যায় এবং 481 এনএম এবং 637 এনএম লেজার লাইনের জন্য একটি ডাইক্রোয়িক মিরর পরে পরিমাপ করা হয়।এটি ফোটন অ্যালিয়াসিং, ফটোব্লিচিং এবং স্যাচুরেশনের প্রভাব এড়িয়ে সর্বোত্তম ফোটন গণনা হার নিশ্চিত করে।μ-স্লাইড এনজিওজেনেসিস কভারস্লিপ বা প্লেটগুলি (ইবিডি জিএমবিএইচ, গ্রেফেলফিং, জার্মানি) একটি সংশোধনমূলক কলার সহ একটি সুপার অ্যাপোক্রোম্যাট 60x এনএ 1.2 লেন্সের উপর সরাসরি নিমজ্জন জলে স্থাপন করা হয়েছিল (অলিম্পাস লাইফ সায়েন্সেস, ওয়ালথাম, ইউএসএ)।একটি 488/640 এনএম ডাইক্রোইক মিরর (সেমরক, লেক ফরেস্ট, আইএল, ইউএসএ) প্রধান বিম স্প্লিটার হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।50 মাইক্রন ব্যাসের একটি গর্ত দ্বারা অকেন্দ্রিক বিকিরণকে অবরুদ্ধ করা হয়, তারপর ফোকাসড রেডিয়েশনকে 50/50 বিম স্প্লিটার দ্বারা 2টি সনাক্তকরণ পাথে বিভক্ত করা হয়।ব্যান্ডপাস নির্গমন ফিল্টার (সেমরক, লেক ফরেস্ট, আইএল, ইউএসএ) সবুজ রঙের জন্য 520/35 (AF488) এবং 690/70 লাল রঙের জন্য (Atto647N) ডিটেক্টরের সামনে ব্যবহার করা হয়েছিল।একক-ফোটন অ্যাভাল্যাঞ্চ ডায়োড (SPAD) (মাইক্রো ফোটন ডিভাইস, বলজানো, ইতালি) ডিটেক্টর হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ SymphoTime64 সফ্টওয়্যার (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany) ব্যবহার করে উভয় ডেটা সংগ্রহ এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
এলএলপিএস নমুনার পঞ্চাশ মাইক্রোলিটার μ-স্লাইড অ্যাঞ্জিওজেনেসিস কূপগুলিতে (ইবিডি জিএমবিএইচ, গ্রেফেলফিং, জার্মানি) প্রয়োগ করা হয়েছিল।ফলস্বরূপ চিত্রগুলি স্থগিত ফোঁটাগুলির জন্য সর্বোত্তম উদ্দেশ্যমূলক কাজের দূরত্বের জন্য কূপের নীচে 20 µm উপরে এবং রাফ্ট এবং বিন্দুগুলির জন্য ~1 µm এ ফোকাস করা হয় যার অক্ষীয় রেজোলিউশন কমপক্ষে 0.25 µm/পিক্সেল এবং 400 µs/পিক্সেলের বিলম্বের সময়।প্রতিটি চ্যানেলের জন্য গড় ব্যাকগ্রাউন্ড সিগন্যাল তীব্রতার (PBG, মানে + 2σ) উপর ভিত্তি করে একটি তীব্রতা থ্রেশহোল্ড প্রয়োগ করে ডেটা নির্বাচন করুন যাতে শুধুমাত্র তরল প্রোটিন ফোঁটা, ভেলা বা দাগ নির্বাচন করা হয়, বিচ্ছুরিত পর্যায় থেকে সম্ভাব্য উৎপত্তি ফিল্টার করে।প্রতিটি চ্যানেলের প্রতিটি প্রজাতির (τ) জীবনকাল বিশ্লেষণ করতে (সবুজ, AF488 এর জন্য "g" এবং লাল, Atto647N এর জন্য "r"), আমরা ফোঁটা, ভেলা বা দাগযুক্ত আগ্রহের অঞ্চলগুলি (ROIs) নির্বাচন করেছি (পরিপূরক চিত্র 1) )8b) এবং তাদের আজীবন ক্ষয় (τD, τR এবং τP ফোঁটা, ভেলা বা দাগের জন্য যথাক্রমে, পরিপূরক চিত্র 8c দেখুন) একটি টেইল-ফিট বিশ্লেষণ এবং একটি দুই-উপাদানের ক্ষয় মডেল ব্যবহার করে প্রতিটি চ্যানেলে ফিট করে তাদের প্রাপ্ত করেছে।গড় τ থেকে τ।ROI গুলি যেগুলি একটি মাল্টি-এক্সপোনেনশিয়াল ফিটের জন্য খুব কম ফোটন তৈরি করে বিশ্লেষণ থেকে বাদ দেওয়া হয়েছিল৷র‍্যাফ্ট এবং বিন্দুর জন্য <104 ফোটন এবং ড্রপের জন্য 103টি কাটঅফ ব্যবহার করা হয়েছে।ফোঁটাগুলির একটি নিম্ন প্রান্তিক রয়েছে কারণ উচ্চতর তীব্রতার মান সহ ক্ষয় বক্ররেখা পাওয়া কঠিন, যেহেতু চিত্র ক্ষেত্রের ফোঁটাগুলি সাধারণত ছোট এবং কম অসংখ্য হয়।ফোটন সংগ্রহের সীমার উপরে ফোটন সংখ্যা সহ ROIগুলি (>500 গণনা/পিক্সেল সেট) বিশ্লেষণের জন্য বাতিল করা হয়েছিল।সমস্ত তীব্রতা ক্ষয়ের জন্য একই বজায় রেখে সর্বনিম্ন IRF হস্তক্ষেপ নিশ্চিত করার জন্য পরিষেবা জীবনের শুরু থেকে সর্বাধিক (ক্ষয়ের সর্বাধিক তীব্রতার সামান্য পরে) 90% তীব্রতার সাথে আগ্রহের অঞ্চল থেকে প্রাপ্ত তীব্রতার ক্ষয় বক্ররেখার সাথে মিল করুন। সেটিংস আপেক্ষিক টাইম উইন্ডো রাফ্ট এবং দাগের জন্য 25 থেকে 50 ROI এবং ড্রপের জন্য 15-25 ROI বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, কমপক্ষে 3টি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে রেকর্ড করা 4টিরও বেশি প্রতিলিপি থেকে নির্বাচিত চিত্রগুলি।দুই-টেইলড টি-পরীক্ষা প্রজাতির মধ্যে বা কোসার্ভেট সিস্টেমের মধ্যে পরিসংখ্যানগত পার্থক্য মূল্যায়ন করতে ব্যবহার করা হয়েছে।জীবনকালের একটি পিক্সেল-বাই-পিক্সেল বিশ্লেষণের জন্য (τ), প্রতিটি চ্যানেলের জন্য ক্ষেত্রের উপর জীবনকালের মোট ক্ষয় গণনা করা হয়েছিল এবং একটি 2/3-কম্পোনেন্ট সূচকীয় অ্যাটেন্যুয়েশন মডেলের একটি আনুমানিক পরিমাপ করা হয়েছিল।প্রতিটি পিক্সেলের জন্য লাইফটাইম অ্যাটেন্যুয়েশনটি পূর্বে গণনা করা τ মান ব্যবহার করে লাগানো হয়েছিল, যার ফলে একটি ছদ্ম রঙের FLIM ফিট চিত্র তৈরি হয়েছিল।টেইল-ফিট লাইফটাইম পরিসীমা একই চ্যানেলের সমস্ত চিত্র জুড়ে একই ছিল এবং প্রতিটি ক্ষয় একটি নির্ভরযোগ্য ফিট প্রদানের জন্য পর্যাপ্ত ফোটন তৈরি করেছিল।FRET বিশ্লেষণের জন্য, 100 ফোটনের একটি নিম্ন তীব্রতা থ্রেশহোল্ড প্রয়োগ করে পিক্সেলগুলি নির্বাচন করা হয়েছিল, যা 11 ফোটনের একটি ব্যাকগ্রাউন্ড সিগন্যাল (FBG) গড়।প্রতিটি চ্যানেলের ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা পরীক্ষামূলকভাবে নির্ধারিত সংশোধন কারণগুলির দ্বারা সংশোধন করা হয়েছিল: 69 বর্ণালী ক্রসস্টাল α ছিল 0.004, সরাসরি উত্তেজনা β ছিল 0.0305, সনাক্তকরণের দক্ষতা γ ছিল 0.517।পিক্সেল স্তরে FRET দক্ষতা তারপর নিম্নলিখিত সমীকরণ ব্যবহার করে গণনা করা হয়:
যেখানে এফডিডি হল দাতা (সবুজ) চ্যানেলে পরিলক্ষিত প্রতিপ্রভ তীব্রতা, এফডিএ হল পরোক্ষ উত্তেজনার অধীনে গ্রহণকারী (লাল) চ্যানেলে পরিলক্ষিত ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা, এবং এফএএ হল প্রত্যক্ষ উত্তেজনার অধীনে গ্রহণকারী (লাল) চ্যানেলে পরিলক্ষিত ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা ( PIE)।চ্যানেলে ফ্লুরোসেন্স তীব্রতার ডাল পরিলক্ষিত হয়)।
LLPS বাফারে 25 µM আনলেবেলবিহীন মনোমেরিক Tau441 (25 µM αS সহ বা ছাড়া) ধারণকারী 100 μl LLPS প্রতিক্রিয়া সমাধানগুলিকে আঠালো ফয়েল আবরণ সহ নন-বাইন্ডিং 96-ওয়েল মাইক্রোপ্লেটে রাখুন এবং ডব্লিউএফ ফর্মের পর মাইক্রোপ্লেট চেক করা হয়েছিল। ভারসাম্য10 মিনিটের মধ্যেকক্ষ তাপমাত্রায় ইনকিউবেশনের 48 ঘন্টা পরে, প্রোটিন রাফ্ট এবং দাগের উপস্থিতি নিশ্চিত করা হয়েছিল।তারপরে সাবধানে কূপগুলি থেকে ভেলাগুলির উপর থেকে তরলটি সরিয়ে ফেলুন, তারপরে 50 লিটার ডিসোসিয়েশন বাফার (10 মিমি HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 মিমি DTT) যোগ করুন এবং 10 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন।উচ্চ লবণের ঘনত্ব নিশ্চিত করে যে অবশিষ্ট পিইজির কারণে এলএলপিএস পুনরাবৃত্তি হবে না এবং শুধুমাত্র ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া দ্বারা গঠিত সম্ভাব্য প্রোটিন সমাবেশগুলি বিচ্ছিন্ন করা হবে।কূপের নীচের অংশটি সাবধানে একটি মাইক্রোপিপেট টিপ দিয়ে স্ক্র্যাপ করা হয়েছিল এবং ফলস্বরূপ সমাধানটি একটি খালি পর্যবেক্ষণ কূপে স্থানান্তরিত হয়েছিল।1 ঘন্টার জন্য 50 μM ThT সহ নমুনাগুলির ইনকিউবেশনের পরে, WF মাইক্রোস্কোপি দ্বারা বিচ্ছিন্ন দাগের উপস্থিতি পরীক্ষা করা হয়েছিল।7 দিনের জন্য একটি অরবিটাল শেকারে 300 μl পিবিএস-এ পিএইচ 7.4, সোডিয়াম অ্যাজাইড 0.01% 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে এবং 200 আরপিএম দিয়ে 70-μM αS দ্রবণের 300 μl ইনকিউবেশন করে সোনিকেটেড αS ফাইব্রিল প্রস্তুত করুন।তারপরে দ্রবণটি 9600×g এ 30 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, পেলেটটি পিবিএস পিএইচ 7.4 এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং সোনিকেট করা হয়েছিল (1 মিনিট, 50% চক্র, 80% প্রশস্ততা একটি Vibra-সেল VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA ফাইব্রিল নমুনা) ছোট ফাইব্রিলগুলির তুলনামূলকভাবে অভিন্ন আকারের বিতরণ সহ।
PIE মোড ব্যবহার করে FLIM-FRET মাইক্রোস্কোপি পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত একই MT200 সময়-সমাধানকৃত ফ্লুরোসেন্ট কনফোকাল মাইক্রোস্কোপে (পিকো-কোয়ান্ট, বার্লিন, জার্মানি) এফসিএস/এফসিসিএস বিশ্লেষণ এবং দ্বি-রঙের কাকতালীয় সনাক্তকরণ (টিসিসিডি) সম্পাদিত হয়েছিল।এই পরীক্ষাগুলির জন্য লেজার শক্তি 6.0 µW (481 nm) এবং 6.2 µW (637 nm) এ যোগ করা হয়েছিল।এই লেজার শক্তিগুলির সংমিশ্রণটি সর্বোত্তম গণনা হার অর্জন এবং ফটোব্লিচিং এবং স্যাচুরেশন এড়ানোর সময় ব্যবহৃত ফ্লুরোফোরের জোড়াগুলির জন্য অনুরূপ উজ্জ্বলতা তৈরি করতে বেছে নেওয়া হয়েছিল।বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ SymphoTime64 সংস্করণ 2.3 সফ্টওয়্যার (PicoQuant, Berlin, Germany) ব্যবহার করে উভয় ডেটা সংগ্রহ এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
LLPS ব্যবহার করে প্রাপ্ত বিচ্ছিন্ন αS/Tau সমষ্টিগুলির নমুনাগুলিকে বিচ্ছিন্ন বাফারে উপযুক্ত মনোমোলিকুলার ঘনত্বে পাতলা করা হয় (সাধারণত একটি 1:500 তরলীকরণ, যেহেতু সমষ্টিগুলি ইতিমধ্যেই কম ঘনত্বে থাকে যখন কোসার্ভেট নমুনাগুলি থেকে বিচ্ছিন্ন হয়)।নমুনাগুলি 1 মিগ্রা/মিলি ঘনত্বে বিএসএ দ্রবণ সহ প্রিকোটেড কভারস্লিপগুলিতে (কর্নিং, ইউএসএ) সরাসরি প্রয়োগ করা হয়েছিল।
সবুজ এবং লাল চ্যানেলগুলিতে PIE-smFRET বিশ্লেষণের জন্য, মনোমেরিক ইভেন্টগুলির কারণে সৃষ্ট কম তীব্রতার সংকেতগুলি ফিল্টার করার জন্য 25 ফোটনের একটি নিম্ন তীব্রতার থ্রেশহোল্ড প্রয়োগ করা হয়েছিল (মনে রাখবেন যে বিচ্ছিন্ন সমষ্টিগুলির তুলনায় মনোমারগুলি সমষ্টিগত নমুনার সংখ্যা ছাড়িয়ে গেছে)।বিশুদ্ধ মনোমার নমুনা বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত মনোমেরিক αS-এর গড় তীব্রতা পাঁচগুণ হিসাবে বিশ্লেষণের জন্য নির্দিষ্টভাবে সমষ্টি নির্বাচন করার জন্য এই থ্রেশহোল্ডটি গণনা করা হয়েছিল।PIE ড্রাইভ সার্কিট, TSCPC ডেটা অধিগ্রহণের সাথে, একটি লাইফটাইম ওয়েটিং ফিল্টার প্রয়োগ করতে সক্ষম করেছে যা ব্যাকগ্রাউন্ড এবং বর্ণালী ক্রসস্টালকে দূর করতে সাহায্য করে।উপরের থ্রেশহোল্ডগুলি ব্যবহার করে নির্বাচিত ফ্লেয়ার তীব্রতা শুধুমাত্র বাফার নমুনার তীব্রতা/বিন বনাম ঘটনার হিস্টোগ্রাম থেকে নির্ধারিত গড় পটভূমি সংকেত ব্যবহার করে সংশোধন করা হয়েছিল।বৃহৎ সমষ্টির সাথে যুক্ত বিস্ফোরণগুলি সাধারণত টাইম ট্রেসে পরপর বেশ কয়েকটি বিন দখল করে (1 ms এ সেট করা)।এই ক্ষেত্রে, সর্বাধিক শক্তির একটি বিন বেছে নেওয়া হয়েছিল।FRET এবং stoichiometric বিশ্লেষণের জন্য, তাত্ত্বিকভাবে নির্ধারিত গামা ফ্যাক্টর γ (0.517) ব্যবহার করা হয়েছিল।ব্যবহৃত উত্তেজনা লেজার শক্তিতে বর্ণালী ক্রসস্টালক এবং সরাসরি উত্তেজনা অবদান নগণ্য (পরীক্ষামূলকভাবে নির্ধারিত)।একটি বিস্ফোরণে FRET এর দক্ষতা এবং স্টোইচিওমেট্রি নিম্নরূপ গণনা করা হয়।