347 স্টেইনলেস স্টীল কয়েলড টিউবিং রাসায়নিক উপাদান ,নভেল ইন্টারফেরন-প্রতিক্রিয়াশীল হিউম্যান লিউকোসাইট অ্যান্টিজেন-এ (এইচএলএ-এ) চ্যাপেরোন প্রোটিন ক্রস-লিঙ্কড ভর স্পেকট্রোমেট্রি (সিএলএমএস) ব্যবহার করে সনাক্তকরণ

Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি সীমিত CSS সমর্থন সহ একটি ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করছেন।সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷উপরন্তু, চলমান সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়া সাইট দেখাই।
স্লাইডার প্রতি স্লাইডে তিনটি নিবন্ধ দেখাচ্ছে৷স্লাইডগুলির মধ্য দিয়ে যেতে পিছনে এবং পরবর্তী বোতামগুলি ব্যবহার করুন, অথবা প্রতিটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যাওয়ার জন্য শেষে স্লাইড কন্ট্রোলার বোতামগুলি ব্যবহার করুন৷

পণ্যের বর্ণনা

স্টেইনলেস স্টীল 347L কয়েল টিউব, ইস্পাত গ্রেড: SS347L

ইন্টারফেরন সিগন্যালিং সিস্টেম পরিবেশ থেকে বিস্তৃত প্যাথোজেনিক এবং অভ্যন্তরীণ প্যাথলজিকাল সংকেতের জন্য একটি শক্তিশালী সাইটোকাইন প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করে, যার ফলে ইন্টারফেরন-ইনডুসিবল প্রোটিনের উপসেটগুলি অন্তর্ভুক্ত হয়।ইন্টারফেরন-প্ররোচিত প্রোটিনের ডোমেনে নতুন প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া সনাক্ত করতে আমরা ডিএসএস-মধ্যস্থ ক্রস-লিঙ্ক ভর স্পেকট্রোমেট্রি (সিএলএমএস) প্রয়োগ করেছি।প্রত্যাশিত ইন্টারফেরন-ইন্ডুসিবল প্রোটিন ছাড়াও, আমরা MX1, USP18, OAS3, এবং STAT1 এর মতো ক্যানোনিকাল ইন্টারফেরন-ইনডুসিবল প্রোটিনের অভিনব আন্তঃআণবিক এবং ইন্ট্রামলিকুলার ক্রস-লিঙ্কড অ্যাডাক্টগুলিও চিহ্নিত করেছি।আমরা এইচএলএ-এ প্রোটিন (H2BFS-HLA-A-HMGA1) দ্বারা গঠিত ইন্টারফেরন-ইন্ডুসিবল প্রোটিন নেটওয়ার্কগুলির একটি অভিনব সেটের অর্থোগোনাল বৈধকরণের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছি কো-ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন ব্যবহার করে এবং আণবিক গতিবিদ্যা মডেলিং ব্যবহার করে তাদের আরও অধ্যয়ন।প্রোটিন কমপ্লেক্সের গঠনগত গতিবিদ্যার মডেলিং বেশ কয়েকটি মিথস্ক্রিয়া সাইট প্রকাশ করেছে যা CLMS ফলাফলগুলিতে চিহ্নিত মিথস্ক্রিয়াগুলিকে প্রতিফলিত করে।একসাথে, আমরা ইন্টারফেরন দ্বারা প্ররোচিত নতুন সিগন্যালিং কমপ্লেক্সগুলি সনাক্ত করতে CLMS-এর একটি পাইলট অধ্যয়ন উপস্থাপন করি এবং টিউমার মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে প্রোটিন মিথস্ক্রিয়াগুলির নতুন গতিশীলতা সনাক্ত করতে CLMS-এর ব্যাপক ব্যবহারের জন্য উন্মুখ।
একটি অভিযোজিত প্রতিরোধমূলক প্রতিক্রিয়া শুরু হওয়ার আগে, হোস্টের সহজাত প্রতিরক্ষা ব্যবস্থা ইন্টারফেরন (IFNs) নামক গোপন আলফা-হেলিকাল সাইটোকাইনগুলির একটি পরিবার দ্বারা মধ্যস্থতা করে একটি অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল প্রতিক্রিয়া মাউন্ট করে।টাইপ I IFN ক্লাস IFNα এবং IFNβ সেলুলার প্রতিক্রিয়া সক্রিয় করে, যার মধ্যে রয়েছে অ্যান্টিভাইরাল, প্রোপোপটোটিক, প্রোইনফ্ল্যামেটরি, এবং অ্যান্টিপ্রোলিফারেটিভ অবস্থা।মানুষের মধ্যে, IFNα এর 13টি উপপ্রকার জানা যায়, সবগুলোই 91 ক্রোমোজোমে ক্লাস্টার করা হয়। আশ্চর্যজনকভাবে, শুধুমাত্র IFNα2 ক্লিনিকাল ব্যবহারের জন্য অধ্যয়ন করা হয়েছে।সম্প্রতি, IFNα-এর অন্যান্য উপ-প্রকারের গবেষণায় বিশেষ মনোযোগ দেওয়া হয়েছে।সাম্প্রতিক একটি সমীক্ষায় দেখা গেছে যে IFNα14 হল এইচবিভি2 এবং এইচআইভি-13,4 প্রতিলিপিকে ক্যানোনিকাল IFNα2 সাব-টাইপের তুলনায় সীমাবদ্ধ করার জন্য সবচেয়ে কার্যকর আইসোফর্মগুলির মধ্যে একটি।
এটি প্রতিষ্ঠিত হয়েছে যে সক্রিয় টাইপ I ইন্টারফেরন রিসেপ্টর কমপ্লেক্স (IFNAR1 এবং IFNAR2) Janus Kinases TYK2 এবং JAK15,6 দ্বারা মধ্যস্থতায় একটি সংকেত ট্রান্সডাকশন ক্যাসকেড ট্রিগার করে।এই জানুস কাইনেস ফসফরিলেট সিগন্যাল ট্রান্সডুসার এবং ট্রান্সক্রিপশনাল প্রোটিন অ্যাক্টিভেটর (STAT1 এবং STAT2) টাইরোসিনের অবশিষ্টাংশে SH2 ডোমেন-মধ্যস্থিত হেটেরোডাইমারাইজেশন শুরু করতে।পরবর্তীকালে, IRF9 STAT হেটেরোডাইমারগুলিকে IFN-উদ্দীপিত ফ্যাক্টর 3 জিনের (ISGF3) একটি ট্রাইমেরিক কমপ্লেক্স গঠনের জন্য আবদ্ধ করে, যা নিউক্লিয়াসে স্থানান্তরিত করে এবং 2000 টিরও বেশি ইন্টারফেরন-উদ্দীপিত জিনের (ISGs) 5,6,7, ট্রান্সক্রিপশন প্ররোচিত করে।
ISGs সহজাত ইমিউন সিস্টেমের মেরুদণ্ড গঠন করে, বিশেষ করে ভাইরাল আক্রমণের প্রতিক্রিয়ায়।ভাইরাল সংক্রমণের বিরুদ্ধে প্রতিরক্ষার প্রথম লাইন হিসাবে, কোষগুলি দ্রুত জৈবিক ক্রিয়াকলাপের বিস্তৃত পরিসরের সাথে সেলুলার প্রোটিনের ব্যাপক মিথস্ক্রিয়া স্থাপন করে।এই প্রোটিনের মধ্যে রয়েছে প্যাটার্ন রিকগনিশন রিসেপ্টর, সিগন্যালিং অণু, ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর এবং সরাসরি অ্যান্টিভাইরাল ফাংশন সহ প্রোটিন, সেইসাথে ইমিউন রেসপন্সের নেতিবাচক নিয়ামক।আইএসজি ক্রিয়াকলাপের বেশিরভাগ তথ্য ওভার এক্সপ্রেশন স্ক্রিন 10,11 বা জিন সাইলেন্সিং কৌশল (siRNA, RNAi এবং CRISPR)12,13 ব্যবহার করে কার্যকরী পর্দা থেকে আসে যেখানে পৃথক ISG প্রকাশ করা হয় বা বাধা দেওয়া হয় এবং তাদের কার্যকলাপ বিভিন্ন ভাইরাসের উপর পরীক্ষা করা হয়।যদিও এই অধ্যয়নগুলি পৃথক ISG-এর অ্যান্টিভাইরাল বৈশিষ্ট্যগুলি নির্ধারণ করেছে, প্রতিটি ISG-এর অন্তর্নিহিত আণবিক প্রক্রিয়াগুলি মূলত অজানা থেকে যায়।এটি সাধারণত গৃহীত হয় যে অনেক প্রোটিন সম্পূর্ণ ক্রিয়াকলাপ নিশ্চিত করতে এক বা একাধিক সাইটোকাইনের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে, তাই হয় আইএসজি সরাসরি যোগাযোগ করে বা তাদের মিথস্ক্রিয়া সেলুলার প্রোটিন দ্বারা মধ্যস্থতা করে।উদাহরণস্বরূপ, সাম্প্রতিক একটি ফটোক্রোসলিঙ্কড প্রোটিওমিক্স স্টাডি ATPase VCP/p97 কে একটি প্রধান IFITM3 মিথস্ক্রিয়া অংশীদার হিসাবে চিহ্নিত করেছে, যার বাধা 14 ভাইরাল কণার সাথে IFITM3 এর লাইসোসোমাল বাছাই, টার্নওভার এবং কোট্রান্সপোর্টে ত্রুটির দিকে পরিচালিত করে।ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন ব্যবহার করে, আমরা VAPA, একটি ভেসিকল-সম্পর্কিত প্রোটিনকে IFITM1/2/3 এর সাথে একটি মিথস্ক্রিয়া অংশীদার হিসাবে চিহ্নিত করেছি যা কোলেস্টেরল-মধ্যস্থ ভাইরাল পরিপক্কতার মধ্যস্থতা করে, এবং এটি একটি খামির টু-হাইব্রিড সিস্টেম ব্যবহার করে অন্য একটি গবেষণার দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল।বৈজ্ঞানিক সহায়তা 15, 16।
সংক্রমণ এবং ম্যালিগন্যান্ট রূপান্তর দমনের সাথে জড়িত একটি মৌলিক জৈবিক প্রক্রিয়া হল অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা, যা প্রধান হিস্টোকম্প্যাটিবিলিটি কমপ্লেক্স (MHC) অণু দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়।ক্লিভড, অকালে শেষ হয়ে যাওয়া বা মিসফোল্ড করা প্রোটিন থেকে পেপটাইড (8-12 অ্যামিনো অ্যাসিড লম্বা) MHC-I হেটেরোডাইমারে লোড করা হয় (MHC-I ভারী এবং হালকা চেইন, যাকে β-2-মাইক্রোগ্লোবুলিন বলা হয়; β2M) 17,18।ফলস্বরূপ স্থিতিশীল MHC-I ট্রাইমারগুলি কোষের পৃষ্ঠে স্থানান্তরিত হয়, যেখানে তারা CD8+ T কোষে (সাইটোটক্সিক টি কোষ) 17 তে অন্তঃকোষীয় পেপটাইড উপস্থাপন করে।টি কোষগুলি এই রোগজীবাণু এবং টিউমার-নির্দিষ্ট অ্যান্টিজেন বহনকারী কোষগুলি সনাক্ত করে এবং ধ্বংস করে।ফলস্বরূপ, রোগজীবাণু এবং টিউমার কোষগুলি প্রায়ই ইমিউন নজরদারি এড়াতে অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা প্রক্রিয়াকে দমন করে।উপরন্তু, MHC-I 40-90% মানুষের টিউমারে নিয়ন্ত্রিত হয় এবং প্রায়শই একটি দরিদ্র পূর্বাভাসের সাথে যুক্ত হয়।
প্যাথোজেনের প্রতিক্রিয়ায় জড়িত জিনগুলিকে অবশ্যই বিশ্রামের অবস্থা এবং সক্রিয় প্রতিলিপির অবস্থার মধ্যে দ্রুত পরিবর্তন করতে হবে।অতএব, প্রোমোটার ক্রোমাটিন 20,21 এর পুনর্নির্মাণ এবং পরিবর্তন সহ স্বল্প সময়ের মধ্যে উচ্চ IFN চাহিদার প্রতিক্রিয়াতে জড়িত বলে অনুমান করা হয় বেশ কয়েকটি সেলুলার প্রোটিন।বেশিরভাগ গবেষণায় IFN এর উপস্থিতিতে পৃথক ISG প্রোটিন অংশীদারদের সনাক্তকরণের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করা হয়েছে।মডেল সেল সিস্টেমে বেশ কিছু প্রোটোমিক এবং ট্রান্সক্রিপ্টমিক স্টাডিজ সেলুলার ল্যান্ডস্কেপে IFN-এর প্রভাবকে ব্যাখ্যা করেছে।যাইহোক, ইন্টারফেরন দ্বারা প্ররোচিত গতিশীলতার ক্রমবর্ধমান বোঝার সত্ত্বেও, আমরা এখনও ISG-এর সম্পৃক্ততা সম্পর্কে খুব কমই জানি।ইন্টারফেরন সিগন্যালিংয়ের জটিলতা এবং সময়-নির্ভর গতিবিদ্যা বিবেচনা করার সময়, দুটি প্রশ্ন উত্থাপিত হয়: (i) দ্রুত সংকেতের সাথে জড়িত মাল্টিপ্রোটিন কমপ্লেক্সগুলিকে স্থিতিশীল করা এবং আটকানো কি সম্ভব, এবং (ii) এই মিথস্ক্রিয়াগুলি কি 3D স্পেসে ম্যাপ করা যেতে পারে?
এই সমস্যাগুলি সমাধানের জন্য, আমরা IFNα-প্ররোচিত প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্ক এবং এর গতিবিদ্যা অধ্যয়নের জন্য ভর স্পেকট্রোমেট্রি (সিএলএমএস) এর সাথে মিলিত ডিসাকসিনিমাইড সাবারেট-মিডিয়াটেড কেমিক্যাল ক্রস-লিঙ্কিং (ডিএসএস) প্রয়োগ করেছি।ডিএসএস ভিভোতে প্রোটিন এবং/অথবা প্রোটিন কমপ্লেক্সের প্রক্সিমাল অবশিষ্টাংশের মধ্যে সমযোজী বন্ধন যোগ করে।পরবর্তী MS বিশ্লেষণ নির্দিষ্ট ক্রসলিংকিং সাইটগুলি প্রকাশ করে যা একটি নির্দিষ্ট প্রোটিনের মধ্যে অঞ্চলগুলির স্থানিক নৈকট্যকে প্রতিফলিত করে, যাকে বলা হয় অভ্যন্তরীণ সংযোগ, বা প্রোটিন কমপ্লেক্সের সাবইউনিট, যাকে বলা হয় আন্তঃসম্পর্ক।এই পদ্ধতিটি ব্যবহার করে, আমরা বেশ কয়েকটি অভিনব প্রোটিন-প্রোটিন কমপ্লেক্সের পাশাপাশি ইন্টারফেরন-প্ররোচিত মাল্টিপ্রোটিন মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্কগুলি চিহ্নিত করেছি।এই নতুন মিথস্ক্রিয়াগুলির একটি উপসেট আরও পরীক্ষা করে, আমরা দেখাই যে H2BFS (H2B হিস্টোন-টাইপ FS; এরপরে H2B হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে) এবং MDN1 HLA-A-এর জন্য বাধ্যতামূলক অংশীদার হিসাবে কাজ করে।
ফ্লো-1 কোষগুলি খাদ্যনালী অ্যাডেনোকার্সিনোমার ভিট্রো মডেলগুলির মধ্যে সবচেয়ে পরিচিত একটি কারণ তারা খাদ্যনালী টিউমারের মূল বৈশিষ্ট্যগুলিকে অনুকরণ করে 22,23৷যাইহোক, সমস্ত টিউমার ইমিউনোজেনিক নয়, এবং ফ্লো-1 কোষ ইন্টারফেরন চিকিৎসায় সাড়া দেয় কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য, আমরা ফ্লো-1 কোষকে 10 এনজি/মিলি IFNα দিয়ে 72 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা করেছি।ফ্লো-1 কোষগুলি pSTAT1 এবং IRF1-এর প্রারম্ভিক সংযোজন দেখায়, চিকিত্সার 2 ঘন্টা পরে শুরু হয় এবং 72 ঘন্টা অব্যাহত থাকে, IRF1 (চিত্র 1A) এর স্থির মাত্রায় সময়-নির্ভর হ্রাসের সাথে।ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, এবং ISG15) 6 ঘন্টা পরে দৃঢ়ভাবে প্ররোচিত হতে দেখা গেছে, IFNα (চিত্র 1A) এর ক্লাসিক মধ্য এবং শেষ পর্যায়ের প্রতিক্রিয়াগুলিকে অনুকরণ করে।একসাথে, এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে এই সেলুলার মডেলটি ইন্টারফেরন প্রতিক্রিয়াগুলি অধ্যয়ন করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।
IFNα চিকিত্সার পরে ফ্লো-1 কোষে ডিফারেনশিয়াল প্রোটিন এক্সপ্রেশন প্রতিক্রিয়া।(A) 2, 6, 24, 48 এবং 72 ঘন্টার জন্য 10 ng/ml IFNα দিয়ে চিকিত্সা করা Flo-1 কোষে প্রোটিনের প্রকাশ নির্দেশিত ISG অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ইমিউনোব্লট দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।(বি) নির্দেশিত সময় এবং ঘনত্বের জন্য ডিএসএস-এর সাথে ক্রস-লিঙ্ক করার পরে সম্পূর্ণ কোষের নির্যাসের কুমাসি নীল দাগযুক্ত এসডিএস-পেজ জেল।(C) প্রোটিন ক্রস-লিঙ্কিংয়ের ডিগ্রি মূল্যায়নের জন্য একই নমুনা থেকে p53(DO-1) অ্যান্টিবডি দিয়ে প্রতিনিধি ইমিউনোব্লট পরীক্ষা করা হয়েছে।
ইন সিটু প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া ল্যান্ডস্কেপ ক্যাপচার করতে, আমরা ডিএসএস ব্যবহার করেছি, এটির উচ্চ ঝিল্লি ব্যাপ্তিযোগ্যতা এবং অপেক্ষাকৃত স্বল্প প্রতিক্রিয়া সময়ের কারণে একটি বহুল ব্যবহৃত ক্রস-লিঙ্কিং এজেন্ট।সংক্ষিপ্ত প্রতিক্রিয়া সময় ক্রসলিঙ্কযুক্ত প্রোটিনের বৃহৎ সমষ্টির গঠন প্রতিরোধ করতে সাহায্য করে, যার ফলে ক্রসলিঙ্কারের স্থিতিশীলতা বজায় থাকে।সর্বোত্তম ডিএসএস ঘনত্ব নির্ধারণ করতে এবং ওভার-ক্রসলিংকিং এড়াতে, আমরা প্রথমে 5, 2.5, এবং 1 মিমি ডিএসএসে যথাক্রমে 5, 10, 5 এবং 30 মিনিটের জন্য কোষগুলি প্রকাশ করেছি এবং Coomassie-stained SDS-PAGE দ্বারা লাইসেটগুলি বিশ্লেষণ করেছি। (উপাত্ত দেখাচ্ছে না) .সেল লাইসেটগুলি সর্বনিম্ন ঘনত্বে এবং সর্বনিম্ন সময় বিন্দুতে অত্যন্ত ক্রস-লিঙ্কযুক্ত বলে মনে হয়।অতএব, ডিএসএসকে 5 মিনিটের মধ্যে 1, 0.5 এবং 0.1 মিমিতে টাইটেরেট করা হয়েছিল (চিত্র 1 বি)।5 মিনিটের জন্য 0.5 মিমি ডিএসএসের সাথে সর্বোত্তম ক্রসলিংকিং পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং এই শর্তগুলি IFNα দিয়ে চিকিত্সা করা কোষগুলির জন্য বেছে নেওয়া হয়েছিল।উপরন্তু, চিত্র 1C প্রোটিন ক্রস-লিঙ্কিং ডিগ্রী মূল্যায়ন করতে p53 (DO-1) অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে সঞ্চালিত একটি ওয়েস্টার্ন ব্লট দেখায়।
ক্রসলিংকার যোগ করার আগে 24 ঘন্টার জন্য ফ্লো-1 কোষগুলিকে 10 এনজি/মিলি IFNα দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল।ক্রস-লিঙ্কযুক্ত কোষগুলি পরবর্তীতে দ্বি-পদক্ষেপ প্রোটিওলাইসিস দ্বারা লাইস করা হয়েছিল এবং প্রোটিনগুলি FASP (চিত্র 2) 24,25 দ্বারা প্রক্রিয়া করা হয়েছিল।ক্রস-লিঙ্কযুক্ত ট্রিপটিক পেপটাইডগুলি ভর স্পেকট্রোমেট্রি (চিত্র 2) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।MS/MS স্পেকট্রা তারপর প্রোটিন অনুক্রমের সাথে মিলে যায় এবং MaxQuant26,27 এর সাথে পরিমাপ করা হয়।সিম-এক্সএল প্রোগ্রাম ব্যবহার করে প্রাপ্ত স্পেকট্রা থেকে ক্রস-লিঙ্কযুক্ত পেপটাইডগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল, এবং পৃথক যৌগগুলিকে xQuest28 এবং SIM-XL29 ওপেন সোর্স কম্পিউটিং সফ্টওয়্যার পাইপলাইনগুলি ব্যবহার করে একটি জটিল নেটওয়ার্কে একত্রিত করা হয়েছিল (চিত্র 2)।সিম-এক্সএল প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া, অভ্যন্তরীণ চেইন এবং স্বতন্ত্র চেইনগুলিকে সরল বা জটিল প্রোটিন মিশ্রণে সনাক্ত করে এবং প্রোটিন কাঠামোর মধ্যে মিথস্ক্রিয়াগুলি কল্পনা করার জন্য স্ক্রিপ্ট সরবরাহ করে।উপরন্তু, এটি প্রতিটি ক্রস-রেফারেন্সকে MS/MS29 স্পেকট্রাম গুণমান অনুসারে একটি আইডি স্কোর হিসাবে স্থান দেয়।বেশ কিছু অত্যন্ত নির্ভরযোগ্য প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া এবং কমপ্লেক্স চিহ্নিত করা হয়েছে, এবং আণবিক গতিবিদ্যা (MD) মডেলিং (চিত্র 2) 30, 31 ব্যবহার করে সহ-ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন এবং কমপ্লেক্সের গঠনগত পরিবর্তন ব্যবহার করে মিথস্ক্রিয়াগুলির একটি নতুন সেট আরও তদন্ত করা হয়েছে।
CLMS পদ্ধতির পরিকল্পিত ওভারভিউ।Flo-1 কোষগুলিকে 10 ng/ml IFNα দিয়ে 24 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল তারপরে DSS ব্যবহার করে সিটু প্রোটিন ক্রস-লিঙ্কিং এর পরে সেল লাইসিস এবং ট্রিপসিনাইজেশন।ক্রস-লিঙ্কযুক্ত নমুনাগুলি একটি অরবিট্র্যাপ ভর স্পেকট্রোমিটার ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং এলসি-এমএস/এমএস-এর সময় পেপটাইড অগ্রদূতের খণ্ডনের জন্য আরও নমুনা করা হয়েছিল।ক্রসলিংকড পেপটাইডস (সিম-এক্সএল) প্রোগ্রামের স্পেকট্রাম রিকগনিশন মেশিন ব্যবহার করে প্রাপ্ত স্পেকট্রা থেকে দুটি লিঙ্কযুক্ত পেপটাইড সনাক্ত করা হয়েছিল এবং সমস্ত যৌগগুলি গণনাগত পাইপলাইন ব্যবহার করে একটি জটিল নেটওয়ার্কে একত্রিত হয়েছিল।মিথ্যা ইতিবাচক হার (FDR) স্কোরের উপর ভিত্তি করে কম আত্মবিশ্বাসের মিথস্ক্রিয়া ফিল্টার করুন।সহ-ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন ব্যবহার করে বেশ কয়েকটি নতুন উচ্চ-বিশ্বস্ত প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া আরও নিশ্চিত করা হয়েছিল এবং আণবিক গতিবিদ্যা (এমডি) মডেলিং ব্যবহার করে কমপ্লেক্সগুলিতে গঠনমূলক পরিবর্তনগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল।
মোট ~30,500 এবং ~28,500 পেপটাইডগুলি যথাক্রমে উদ্দীপিত এবং উদ্দীপিত IFNα নমুনায় MaxQuant ব্যবহার করে সনাক্ত করা হয়েছে (পরিপূরক সারণী S1, চিত্র 3A)।উভয় ক্ষেত্রেই পেপটাইড দৈর্ঘ্য বন্টন বৃহত্তর পেপটাইডের উচ্চ অনুপাত দেখিয়েছে, যা ক্রস-লিঙ্কযুক্ত পেপটাইডের উপস্থিতি নির্দেশ করে (চিত্র 3B,C)।উপরন্তু, IFNα-চিকিত্সা করা নমুনাগুলিতে (চিত্র 3C) 40-55 পরিসরে বৃহত্তর পেপটাইডগুলির একটি বৃহত্তর অনুপাত উপস্থিত ছিল।লগ 2 তীব্রতার বিরুদ্ধে প্রোটিন ম্যাপিং দেখায় যে MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, এবং HLA-F (চিত্র 3D) সহ চিকিত্সা না করা নমুনার তুলনায় ক্লাসিক ইন্টারফেরন-উদ্দীপিত প্রোটিনগুলি সর্বাধিক প্রচুর।রিঅ্যাক্টোম পাথওয়ে ডাটাবেস ব্যবহার করে IFNα চিকিত্সার প্রতিক্রিয়ায় তিনগুণেরও বেশি সমৃদ্ধ প্রোটিনের জন্য পথের বিশ্লেষণ দেখায় যে MHC-I-মধ্যস্থ অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা এবং প্রক্রিয়াকরণ ছিল সবচেয়ে প্রভাবশালী পথ (চিত্র 3E)।পূর্বের রিপোর্টগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, OAS এবং ISG15 দ্বারা মধ্যস্থতা করা অ্যান্টিভাইরাল প্রতিক্রিয়াগুলির পাশাপাশি IFNα/β এবং সাইটোকাইন সংকেতগুলি সক্রিয় করা পথগুলির মধ্যে ছিল।এছাড়াও, লাইসিন- এবং সেরিন-নির্দিষ্ট প্রোটিন ক্রস-লিঙ্কগুলি সিম-এক্সএল ব্যবহার করে মূলত অর্জিত এমএস/এমএস স্পেকট্রা থেকে চিহ্নিত করা হয়েছিল।একটি সাম্প্রতিক সমীক্ষায় 5 টি কোষের পৃথক ISG ওভার এক্সপ্রেশন অধ্যয়নের মেটা-বিশ্লেষণের মাধ্যমে 9টি ভাইরাস শ্রেণি থেকে 20টি ভাইরাস ছড়িয়ে থাকা 104টি আইএসজি রিপোর্ট করা হয়েছে।যাইহোক, বড় ডেটাসেট স্ক্রীন করার গণনাগত সীমাবদ্ধতাগুলি কাটিয়ে উঠতে, আমরা একটি ছোট ডেটাসেট দিয়ে শুরু করেছি পাদারিয়া এট আল দ্বারা রিপোর্ট করা আইআরডিএস জিনের তালিকার মধ্যে সম্ভাব্য মিথস্ক্রিয়া অন্বেষণ করতে, যার বেশিরভাগই আইএসজি।
IFNα (MaxQuant থেকে প্রাপ্ত ডেটা) এর প্রতিক্রিয়ায় ভিন্নভাবে প্রকাশিত ক্রস-লিঙ্কযুক্ত প্রোটিনগুলির সনাক্তকরণ।(A) ভেন ডায়াগ্রাম যা IFNα14 চিকিত্সা করা এবং চিকিত্সা না করা ফ্লো-1 নমুনাগুলিতে চিহ্নিত সাধারণ এবং একচেটিয়া পেপটাইডের সংখ্যা উপস্থাপন করে।চিকিত্সাবিহীন (B) এবং IFNα চিকিত্সা করা (C) ক্রসলিঙ্কযুক্ত নমুনার পেপটাইড দৈর্ঘ্য বিতরণ।(D) তাপ মানচিত্র অনুপস্থিত এবং IFNα14 চিকিত্সা করা Flo-1 কোষগুলির মধ্যে লগ 2 (LFQ তীব্রতা) উপস্থাপন করে।বাম প্যানেলটি IFNα-এর উপস্থিতিতে প্রোটিনগুলি সবচেয়ে সক্রিয়ভাবে সক্রিয় দেখায়।(ই) হিস্টোগ্রাম IFNα চিকিত্সার পরে 20টি প্রধান সমৃদ্ধি পথের প্রতিনিধিত্ব করে।রিঅ্যাক্টোম পাথওয়ে ডাটাবেস আপ-রেগুলেটেড IFNα- প্রতিক্রিয়াশীল প্রোটিনের চারগুণেরও বেশি পরিবর্তন বিশ্লেষণ করেছে।
ইন্টারফেরন-মধ্যস্থ আইএসজি উদ্দীপনা ভালভাবে নথিভুক্ত করা হয়েছে, কিন্তু আণবিক স্তরে এটি খারাপভাবে বোঝা যায় যে কীভাবে এই প্রোটিনগুলি বিস্তৃত জৈবিক ক্রিয়াকলাপে পরিণত হয়।আমরা পরিচিত আইএসজিগুলির মধ্যে উচ্চ মাত্রার আত্মবিশ্বাসের সাথে প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া তদন্ত করেছি।মজার বিষয় হল, আমরা MX1, USP18, ROBO1, OAS3, এবং STAT1 প্রোটিন সহ একটি নেটওয়ার্ক সনাক্ত করেছি যা IFNα চিকিত্সার (চিত্র 4, টেবিল S2) 32,33,34 এর প্রতিক্রিয়াতে একটি বড় জটিল গঠন করে।সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণভাবে, এই মিথস্ক্রিয়াগুলি IFNα এর সাথে চিকিত্সা করা সমস্ত ট্রিপ্লিকেটগুলিতে পাওয়া গেছে এবং চিকিত্সা না করা নমুনাগুলিতে পাওয়া যায়নি, পরামর্শ দেয় যে সেগুলি বিশেষভাবে IFNα চিকিত্সার প্রতিক্রিয়া হিসাবে গঠিত হয়েছিল।এটা জানা যায় যে STAT1 ট্রান্সক্রিপশনভাবে এই ISG-এর অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করে, কিন্তু প্রোটিন স্তরে ISG-এর সাথে এর মিথস্ক্রিয়া অধ্যয়ন করা হয়নি।STAT1 এর স্ফটিক কাঠামো দেখায় যে এর হেলিকাল ডোমেন (CCD) dimers35 গঠনের সময় DNA বা প্রোটোমারের সাথে মিথস্ক্রিয়ায় জড়িত নয়।এই α-হেলিসগুলি একটি হেলিকাল হেলিক্স গঠন গঠন করে যা মিথস্ক্রিয়া ঘটানোর জন্য একটি প্রধানত হাইড্রোফিলিক পৃষ্ঠ এলাকা প্রদান করে।আমাদের CLMS ডেটাতে, আমরা লক্ষ্য করেছি যে STAT1 এর সাথে বেশিরভাগ মিথস্ক্রিয়া সিসিডি, লিঙ্কার ডোমেন, বা সি-টার্মিনাল টেল (অবশিষ্ট 700-708) (চিত্র 4A) এর পূর্বের SH2 ডোমেনে ঘটেছে।পূর্ববর্তী একটি সমীক্ষায় জানা গেছে যে USP18 STAT2 এর CCD এবং DNA-বাইন্ডিং ডোমেন (DBD) এর সাথে আবদ্ধ হয় এবং টাইপ I ইন্টারফেরন সংকেত 24-এর নিষেধাজ্ঞার মধ্যস্থতা করতে টাইপ I ইন্টারফেরন রিসেপ্টর IFNAR2 এর সাবইউনিটে নিয়োগ করা হয়।আমাদের ডেটা আরও দেখিয়েছে যে USP18 অনুঘটক ডোমেন STAT1 DBD (চিত্র 4A,D) এর সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করে, পরামর্শ দেয় যে STAT1 এবং STAT2 উভয়ই USP18 কে IFNAR2 এর দিকে আকৃষ্ট করতে ভূমিকা পালন করতে পারে।
প্রোটিন-প্রোটিন আইএসজি নেটওয়ার্ক IFNα এর সাথে চিকিত্সা করা ক্রস-লিঙ্কড কোষগুলিতে চিহ্নিত।(A) 2D মিথস্ক্রিয়া প্লট প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া দেখায় (সিম-এক্সএল প্রোগ্রামে তৈরি), আন্তঃআণবিক মিথস্ক্রিয়া প্রতিনিধিত্বকারী লাইন সহ (ক্রসলিংক কাটঅফ 3.5 সেট করা হয়েছে)।বিভিন্ন পরিচয়ের ডোমেনগুলি তাদের রঙ দ্বারা চিহ্নিত করা হয়32: MX1 ডোমেন, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), এবং GED (569–660)।OAS3 ডোমেন: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), এবং OAS1_C (903-108)।ডোমেন ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) এবং fn3 (777–864)।STAT1 ক্ষেত্র: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), এবং STAT1_TAZ2bind (715–739)।(বি) ক্রস-লিঙ্কযুক্ত প্রোটিনগুলির সার্কুলার ভিউয়ার (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 এবং STAT1) যথাক্রমে নীল এবং লাল লেবেলযুক্ত মিথস্ক্রিয়া এবং মিথস্ক্রিয়াগুলির সাথে।ক্রস-লিঙ্ক থ্রেশহোল্ড 3.5 এ সেট করা হয়েছিল।ডট প্লটগুলি MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), এবং OAS3 (F), পাশাপাশি দুটি পেপটাইডের মধ্যে K বা S মিথস্ক্রিয়া সাইটগুলির সাথে STAT1 মিথস্ক্রিয়া সাইটগুলি নির্দেশ করে৷চিত্রে, ক্রস-লিঙ্ক স্কোর থ্রেশহোল্ড 3.0 এ সেট করা হয়েছে।(G) STAT1 এবং OAS3 DI ডোমেনগুলির মধ্যে বিভিন্ন মিথস্ক্রিয়া সাইটগুলি PyMol-এ তাদের প্রোটিন কাঠামোর উপর চাপিয়ে দেওয়া হয়েছে (PyMOL আণবিক গ্রাফিক্স সিস্টেম, সংস্করণ 2.0 Schrödinger, LLC);STAT1 (pdb id: 1bf533) এবং OAS3 (pdb id: 4s3n34)।) কার্যক্রম.
মানুষের মধ্যে USP18-এর দুটি আইসোফর্ম বর্ণনা করা হয়েছে, একটি পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের প্রোটিন যা প্রধানত নিউক্লিয়াসে অবস্থিত, এবং একটি এন-টার্মিনাল ডোমেন ছাড়াই একটি আইসোফর্ম, USP18-sf, যা সাইটোপ্লাজম এবং নিউক্লিয়াস 36-এ সমানভাবে বিতরণ করা হয়।উপরন্তু, এন-টার্মিনাসকে অসংগঠিত বলে ভবিষ্যদ্বাণী করা হয়েছিল এবং এর জন্য আইসোপেপ্টিডেস কার্যকলাপ বা আইএসজি1537 বাইন্ডিংয়ের প্রয়োজন নেই।আমাদের গবেষণায় চিহ্নিত বেশিরভাগ মিথস্ক্রিয়া প্রোটিনের এন-টার্মিনাসে অবস্থিত ছিল, পরামর্শ দেয় যে এই মিথস্ক্রিয়াগুলি পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের ইউএসপি 18 (চিত্র 4A, D) জড়িত এবং এইভাবে সম্ভবত নিউক্লিয়াসে ঘটতে পারে।তদুপরি, আমাদের ডেটা এও নির্দেশ করে যে এন-টার্মিনাস প্রোটিন-থেকে-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়াগুলির জন্য বিশেষ।IFNAR2 বাইন্ডিং সাইটটি অবশিষ্টাংশ 312-368 এর মধ্যে অবস্থিত, এবং উল্লেখযোগ্যভাবে, জটিল প্রোটিনগুলির কোনটিই এই অঞ্চলের সাথে আবদ্ধ নয় (চিত্র 4A) 37,38৷একসাথে নেওয়া এই ডেটাগুলি নির্দেশ করে যে IFNAR2 বাইন্ডিং ডোমেন একচেটিয়াভাবে রিসেপ্টর প্রোটিন দ্বারা ব্যবহৃত হয়।উপরন্তু, শুধুমাত্র OAS3 এবং ROBO1 N-টার্মিনাস এবং IFNAR2 বাইন্ডিং সাইট (চিত্র 4A) এর আপস্ট্রিম ডোমেনের সাথে যুক্ত পাওয়া গেছে।
ROBO1 ট্রান্সমেমব্রেন সিগন্যালিং অণুগুলির ইমিউনোগ্লোবুলিন (Ig) সুপারফ্যামিলির অন্তর্গত এবং এক্সট্রা সেলুলার অঞ্চলে পাঁচটি Ig ডোমেইন এবং তিনটি ফাইব্রোনেক্টিন (Fn) ডোমেন নিয়ে গঠিত।এই বহির্কোষী ডোমেনগুলি একটি ঝিল্লি-প্রক্সিমাল অঞ্চল এবং একটি একক ট্রান্সমেমব্রেন হেলিক্স 39 দ্বারা অনুসরণ করা হয়। একটি অগঠিত অন্তঃকোষীয় অঞ্চল সি-টার্মিনাসে অবস্থিত এবং এতে সংরক্ষিত সিকোয়েন্স মোটিফ রয়েছে যা প্রভাবক প্রোটিন বাইন্ডিংকে মধ্যস্থতা করে।অ্যামিনো অ্যাসিড ~ 1100 থেকে 1600 পর্যন্ত বিস্তৃত অঞ্চলটি বেশিরভাগ বিশৃঙ্খল।আমরা দেখতে পেয়েছি যে MX1 ROBO1 এর সাথে Ig, Fn এবং ইন্ট্রাসেলুলার ডোমেনের মাধ্যমে ইন্টারঅ্যাক্ট করে, যখন STAT1 এর সাথে বেশিরভাগ মিথস্ক্রিয়া তার CCD, লিঙ্কার ডোমেন এবং ROBO1 এর C-টার্মিনাস (চিত্র 4A,E) এর মধ্যে ঘটে।অন্যদিকে, DI, DIII, এবং OAS3 লিঙ্কার অঞ্চলগুলির সাথে মিথস্ক্রিয়াগুলি ROBO1 প্রোটিন জুড়ে বিতরণ করা হয়েছিল (চিত্র 4A)।
অলিগোডেনাইলেট সিন্থেস (ওএএস) প্রোটিন পরিবার আন্তঃকোষীয় ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড আরএনএ (ডিএসআরএনএ) গ্রহণ করে এবং আবদ্ধ করে, গঠনমূলক পরিবর্তনের মধ্য দিয়ে যায় এবং 2′,5′-সংযুক্ত অলিগোডেনিলেটস (2-5 হিসাবে) 40 সংশ্লেষিত করে।এটি পাওয়া গেছে যে তিনটি OAS-এর মধ্যে, OAS3 dsRNA-এর জন্য সর্বোচ্চ সখ্যতা প্রদর্শন করে এবং সর্বনিম্ন পরিমাণে 2-5 As সংশ্লেষিত করে, যা RNase L সক্রিয় করতে পারে এবং এর ফলে ভাইরাল প্রতিলিপি 41 সীমাবদ্ধ করে।OAS পরিবার পলিমারেজ বিটা (pol-β)-এর মতো নিউক্লিওটাইড ট্রান্সফারেজ ডোমেন নিয়ে গঠিত।পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখানো হয়েছে যে সি-টার্মিনাল ডোমেইন (ডিআইআই) এর অনুঘটক কার্যকলাপ dsRNA-বাইন্ডিং ডোমেন (DI) এর উপর নির্ভরশীল, যা OAS342 সক্রিয়করণের জন্য প্রয়োজনীয়।আমরা লক্ষ্য করেছি যে OAS3 এর DI এবং DII ডোমেনগুলি CCD এবং SH2 এবং STAT1 TAD (চিত্র 4A, F) এর মধ্যে একটি ছোট জংশন অঞ্চলের সাথে যোগাযোগ করে।প্রোটিন কাঠামোর উপর বিভিন্ন ক্রসলিংকিং সাইটগুলিকে ওভারলে করা β-শীট ​​এবং DBD STAT1 লুপ এবং OAS3 (চিত্র 4G) এর DI ডোমেনে অবশিষ্টাংশ 60-75 দ্বারা গঠিত একটি খোলা পকেট বা গহ্বরের মধ্যে একটি মিথস্ক্রিয়া প্রকাশ করে।কমপ্লেক্সের প্রোটিনগুলির স্থিতিবিন্যাসও নির্দেশ করে যে OAS3-এর সাথে কোনও মিথস্ক্রিয়াই এর DI ডোমেনের (চিত্র S1A) ডিএনএ-বাঁধাই ক্ষমতার সাথে হস্তক্ষেপ করেনি।উপরন্তু, GTPase MX1 এর N-টার্মিনাল ডোমেন OAS3 (চিত্র 4A) এর DI এবং DIII ডোমেনের সাথে ব্যাপকভাবে যোগাযোগ করে।আমরা তিনটি IFNα-চিকিত্সা করা পুনরাবৃত্তিতে OAS1 এবং MX1 এর মধ্যে একটি মিথস্ক্রিয়াও পর্যবেক্ষণ করেছি, যেখানে একটি একক OAS1 ডোমেন (এছাড়াও অনুঘটকভাবে সক্রিয়) তিনটি MX1 ডোমেনের সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করেছে (চিত্র S2A,B)।
এমএক্স প্রোটিনগুলি ডাইনিন-সদৃশ GTPases-এর একটি বৃহৎ পরিবারের অংশ যাতে একটি N-টার্মিনাল GTPase ডোমেন থাকে যা GTP কে আবদ্ধ করে এবং হাইড্রোলাইজ করে, একটি মধ্যবর্তী ডোমেন যা স্ব-সমাবেশে মধ্যস্থতা করে এবং একটি C-টার্মিনাল লিউসিন জিপার যা GTPase (LZ) হিসাবে কাজ করে )ডোমেইন ইফেক্টর ডোমেইন25,43.MX1 ভাইরাল জিনের ট্রান্সক্রিপশন ব্লক করতে ভাইরাল পলিমারেজের সাবইউনিটের সাথে আবদ্ধ হয়।পূর্বে রিপোর্ট করা ইস্ট টু-হাইব্রিড স্ক্রীনে দেখানো হয়েছে যে PIAS1-সংশ্লিষ্ট MX1 ডিএনএ-বাইন্ডিং অ্যাক্টিভিটি ব্লক করে STAT1-মধ্যস্থিত জিন অ্যাক্টিভেশনকে বাধা দেয় এবং SUMO E344,45 ligase কার্যকলাপও রয়েছে।এখানে, আমরা দেখাই যে MX1 STAT1 (চিত্র 4C,D) এর সাথে আবদ্ধ, তবে কীভাবে এই মিথস্ক্রিয়াটি IFNα এর প্রতিক্রিয়ায় STAT1-মধ্যস্থ জিন সক্রিয়করণকে প্রভাবিত করে তা আরও অধ্যয়নের প্রয়োজন।উপরন্তু, আমরা আরও দেখতে পেলাম যে MX1 তিনটি IFNα-চিকিত্সা করা পুনরাবৃত্তিতে IFIT3 এবং DDX60 এর সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করেছে (চিত্র S2C)।
DDX60 হল একটি IFN-প্ররোচিত সাইটোপ্লাজমিক হেলিকেস যা পূর্বে ভাইরাল RNA46-এর RIG-I-স্বতন্ত্র অবক্ষয়ে ভূমিকা পালন করে বলে জানা গেছে।এটি RIG-I এর সাথে যোগাযোগ করে এবং লিগ্যান্ড-নির্দিষ্ট পদ্ধতিতে এর সংকেত সক্রিয় করে 46. DDX60 একটি DEXD/H-Box হেলিকেস ডোমেন এবং একটি C-টার্মিনাল হেলিকেস ডোমেন নিয়ে গঠিত যা ভাইরাল RNA এবং DNA47 কে আবদ্ধ করে।MX1 এবং IFIT3 এর সাথে এর বেশিরভাগ মিথস্ক্রিয়া ক্যানোনিকাল ডোমেন বা মোটিফ ছাড়াই দীর্ঘ N- এবং C-টার্মিনাল অঞ্চলের মধ্যে ঘটে (চিত্র S2E,F)।যাইহোক, MX1 এছাড়াও DEXD/H-Box হেলিকেস ডোমেইন (চিত্র S2E) এর সাথে যুক্ত।IFIT পরিবারের প্রোটিনগুলিতে টেট্রাপেপটাইড রিপিট (TPR) নামে একটি স্বতন্ত্র হেলিক্স-টার্ন-হেলিক্স মোটিফের টেন্ডেম কপি রয়েছে।IFIT3 RIG-I সিগন্যালিংয়ের একটি ইতিবাচক মডুলেটর এবং তাই MAVS কমপ্লেক্সের একটি উপাদান হিসাবে পাওয়া গেছে।একত্রে নেওয়া, আমাদের ডেটা পরামর্শ দেয় যে IFIT3 এবং DDX60 প্রাথমিকভাবে IFIT3-এর TPR 3-6-এর মধ্যবর্তী অঞ্চলে ইন্টারঅ্যাক্ট করে এবং RIG-I/MAVS সিগন্যালিং (চিত্র S2F) এ ভূমিকা পালন করতে পারে।
প্রদত্ত যে সমগ্র প্রোটিওম স্ক্রীনিং গণনামূলকভাবে নিবিড়, আমরা তারপরে IFNα-চিকিত্সা করা পুনরাবৃত্তিগুলির একটির উপস্থিতির জন্য সমগ্র মানব ইউনিপ্রোট ডাটাবেস স্ক্রীন করেছি।এই প্রতিরূপটিতে, আমরা HLA-A-এর জন্য বেশ কয়েকটি অত্যন্ত নির্ভরযোগ্য মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্ক খুঁজে পেয়েছি।MS/MS স্পেকট্রা দ্বারা চিহ্নিত প্রোটিন পথের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে MHC-I-ভিত্তিক অ্যান্টিজেন প্রক্রিয়াকরণ এবং উপস্থাপনা হল ইন্টারফেরন (চিত্র 3D) দ্বারা প্ররোচিত প্রধান পথ।অতএব, আমরা সমস্ত ক্রস-লিঙ্কযুক্ত নমুনায় উচ্চ মাত্রার আত্মবিশ্বাসের সাথে MHC-I অণুর প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া অধ্যয়নের দিকে মনোনিবেশ করেছি।এইচএলএ α1, α2 এবং α3 ডোমেন এবং হালকা চেইন নিয়ে গঠিত এবং মাইক্রোগ্লোবুলিন β2 (β2m) একটি ধ্রুবক চ্যাপেরোন প্রোটিন49।একবার এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলামে একত্রিত হলে, পেপটাইড লিগ্যান্ড 50 এর অনুপস্থিতিতে এইচএলএ অস্থির।পেপটাইড-বাইন্ডিং খাঁজটি অ-পেপটাইড আকারে অত্যন্ত পলিমরফিক এবং অসংগঠিত α1 এবং α2 ডোমেন এবং তুলনামূলকভাবে কম পলিমরফিক α351 ডোমেন দ্বারা গঠিত হয়।IFNα এর উপস্থিতিতে, আমরা দুটি HLA-A কমপ্লেক্স সনাক্ত করেছি: একটি HMGA1 এবং H2B (চিত্র 5, টেবিল S3) এর সাথে যোগাযোগ করে এবং অন্যটি MDN1, LRCH4 এবং H2B (চিত্র 6) এর সাথে যোগাযোগ করে।
IFNα H2B (H2BFS) এবং HMGA1 এর সাথে একটি HLA-A মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্ক প্ররোচিত করে।(A) 2D প্লট (SIM-XL সফ্টওয়্যারে তৈরি) H2B-HLA-A-HMGA1 কমপ্লেক্সে বিভিন্ন ধরনের মিথস্ক্রিয়া চিত্রিত করে: ইন্টারলিঙ্ক (নীল), ইন্টারলিঙ্ক (লাল) এবং একক লিঙ্ক (কালো)।.বিভিন্ন পরিচয়ের ডোমেন হল কালার কোডেড 32: H2B (হিস্টোন; 2-102) এবং MHC-I (MHC_1; 25-203, গ্রুপ C1; 210-290 এবং MHC_I_C; 337-364)।ক্রস-লিঙ্ক থ্রেশহোল্ড 3.5 এ সেট করা হয়েছিল।ডট প্লটগুলি H2B (B) এবং HMGA1 (C) এর সাথে HLA-A মিথস্ক্রিয়া সাইটগুলির পাশাপাশি দুটি পেপটাইডের মধ্যে K বা S মিথস্ক্রিয়া সাইটগুলি নির্দেশ করে।চিত্রে, ক্রস-লিঙ্ক স্কোর থ্রেশহোল্ড 3.0 এ সেট করা হয়েছে।(D) PyMOL প্রোগ্রামে H2B, HLA-A, এবং HMGA1 প্রোটিনের কাঠামোতে দেখানো প্রোটিনের মধ্যে সম্পর্ক।এই কাঠামোগুলি Phyre2 সার্ভার (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ব্যবহার করে মডেল করা হয়েছিল এবং H2B, HLA-A এবং HMGA1 প্রোটিনের জন্য টেমপ্লেট কাঠামো যথাক্রমে 1kx552, 1kj349 এবং 2eze55 ছিল।
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 এবং LRCH4 এর সাথে একটি HLA-A মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্ককে প্ররোচিত করে।(A) একটি 2D ইন্টারেক্টিভ মানচিত্রে (সিম-এক্সএল সফ্টওয়্যারে তৈরি) আন্তঃআণবিক (লাল) এবং আন্তঃআণবিক (নীল) ক্রসলিঙ্কগুলি MDN1 একটি বৃত্ত হিসাবে উপস্থাপিত।ক্রস-লিঙ্ক থ্রেশহোল্ড 3.5 এ সেট করা হয়েছিল।বিভিন্ন পরিচয়ের ডোমেন হল কালার কোডেড 32: H2B (হিস্টোন; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, গ্রুপ C1; 210-290 এবং MHC_I_C; 337-364) এবং LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137–194) এবং CH (535–641))।(B) PyMOL প্রোগ্রামে H2B, HLA-A, LRCH4 এবং MDN1 প্রোটিনের কাঠামোতে দেখানো প্রোটিনের মধ্যে সম্পর্ক।H2B, HLA-A, LRCH4 এবং MDN1 প্রোটিনের জন্য 1kx552, 1kj349, 6hlu62 এবং 6i2665 টেমপ্লেট কাঠামো সহ Phyre2 সার্ভার (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ব্যবহার করে এই কাঠামোগুলি তৈরি করা হয়েছিল, যথাক্রমেH2B (C), LRCH4 (D), এবং MDN1 (E) এর সাথে HLA-A-এর জন্য K বা S ইন্টারঅ্যাকশন সাইট দেখানো ডট প্লট।প্লটের জন্য, ক্রস-লিঙ্ক স্কোর থ্রেশহোল্ড 3.0 সেট করা হয়েছিল।
জিনোমের অখণ্ডতা বজায় রাখার পাশাপাশি, হিস্টোন H2B ট্রান্সক্রিপশন নিয়ন্ত্রণের সাথে জড়িত।H2B প্রোটিন একটি সেন্ট্রাল হিস্টোন ডোমেইন (HFD) নিয়ে গঠিত যা তিনটি α-হেলিস দ্বারা বিভক্ত লুপ এবং একটি C-টার্মিনাল টেল 41,52 দ্বারা গঠিত।H2B এর সাথে বেশিরভাগ মিথস্ক্রিয়া ঘটে α1 হেলিক্সে, যা HFD হেটেরোডাইমার (চিত্র 5A,B) এর সাথে ট্রাইমারাইজেশন প্রদান করে।যদিও লাইসিনগুলি ডিএনএ বাঁধাইয়ের সাথে জড়িত, কিছু লাইসিন বিকল্প অ্যাসিটিলেশন বা মেথিলেশন সাইটও।উদাহরণস্বরূপ, H2B থেকে K43, K46, এবং K57 অবশিষ্টাংশগুলি সরাসরি DNA বাইন্ডিংয়ের সাথে জড়িত নয়, কিন্তু বিভিন্ন পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল পরিবর্তনের লক্ষ্যমাত্রা।একইভাবে, H2B-এর অবশিষ্টাংশ K44, K47, এবং K57 অন্যান্য প্রোটিনের সাথে মিথস্ক্রিয়া সহ IFNα-এর উপস্থিতিতে বিকল্প ভূমিকা পালন করতে পারে (চিত্র 5A, B)।উপরন্তু, এক্সট্রাক্রোমোসোমাল হিস্টোন H2B বিভিন্ন কোষের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা সক্রিয় করে, যা সংক্রামক এজেন্ট বা ক্ষতিগ্রস্ত কোষ থেকে প্রাপ্ত ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ (dsDNA) খণ্ড সনাক্ত করতে সাইটোসোলিক সেন্সর হিসেবে কাজ করে।ডিএনএ ভাইরাসের উপস্থিতিতে, H2B হ্রাস IFN-β উৎপাদন এবং STAT154 ফসফোরিলেশনকে বাধা দেয়।H2B অন্যান্য কোর হিস্টোনের তুলনায় দ্রুত নিউক্লিয়াসের ভিতরে এবং বাইরে যেতেও পরিচিত।MDN1 এবং LRCH4 এর সাথে H2B মিথস্ক্রিয়াগুলি নির্বাচিত চিকিত্সাবিহীন নমুনাগুলিতেও পরিলক্ষিত হয়েছিল।আমরা দেখতে পেয়েছি যে HLA-A তিনটি IFNα-চিকিত্সা করা নমুনায় এবং একটি চিকিত্সা না করা পুনরাবৃত্তি নমুনায় H2B এর সাথে যোগাযোগ করেছে।এই ডেটা ট্রান্সক্রিপশনাল রেগুলেশন থেকে স্বাধীন একটি বিকল্প শারীরবৃত্তীয় ফাংশনে H2B এর ভূমিকা প্রতিফলিত করে।
HMGA1 (হাই মোবিলিটি গ্রুপ AT-Hook 1), রোগ-উন্নয়নকারী অ্যামিনো অ্যাসিড সমৃদ্ধ একটি ছোট নিউক্লিওপ্রোটিন, এইচএলএ-এ-এর সাথে যুক্ত হয়ে চিহ্নিত করা হয়েছে।এটির একটি অম্লীয় সি-টার্মিনাল লেজ এবং তিনটি স্বতন্ত্র ডিবিডি রয়েছে যাকে AT হুক বলা হয় কারণ তারা dsDNA55,56 এ AT-সমৃদ্ধ অঞ্চলের ছোট খাঁজের সাথে আবদ্ধ হয়।এই বাঁধাই ডিএনএকে বাঁকানো বা সোজা করে দেয়, যা ক্যানোনিকাল ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলিকে এর সম্মতি ক্রম অ্যাক্সেস করতে দেয়।সি-টার্মিনাল লেজ প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া এবং ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর নিয়োগের সাথে জড়িত বলে মনে করা হয়, যেহেতু সি-টার্মিনাল ডিলিট মিউট্যান্টরা ট্রান্সক্রিপশন শুরু করতে অক্ষম।অধিকন্তু, এই ডোমেনে বেশ কয়েকটি সংরক্ষিত ফসফোরিলেশন সাইট রয়েছে যা কিনাসেস 58 এর জন্য পরিচিত সাবস্ট্রেট।আমরা C-টার্মিনাল ডোমেনের বাইরে HMGA1-এর সাথে HLA-A এবং H2B মিথস্ক্রিয়া পর্যবেক্ষণ করেছি, পরামর্শ দিয়েছি যে C-টার্মিনাল ডোমেন প্রধানত ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর বাইন্ডিং (চিত্র 5A, C) এর জন্য ব্যবহৃত হয়।এইচএমজিএ প্রোটিনগুলি অ্যাডাপ্টার ডিএনএর সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য হিস্টোন এইচ1 এর সাথে প্রতিযোগিতা করে, যার ফলে অ্যাক্সেসযোগ্যতা বৃদ্ধি পায়57।একইভাবে, মনে হচ্ছে যে HMGA হিস্টোন H1 এর সাথে প্রতিযোগিতায় লিঙ্কার DNA বরাবর হিস্টোন H2B এর সাথে যোগাযোগ করে।HMGB1 ডেনড্রাইটিক কোষগুলিতে HLA-A, -B, এবং -C-এর অভিব্যক্তিকে প্ররোচিত করে, যা তাদের সক্রিয়করণের দিকে পরিচালিত করে, কিন্তু HMG এবং HLA-এর মধ্যে একটি মিথস্ক্রিয়া পূর্বে রিপোর্ট করা হয়নি।আমরা দেখতে পেয়েছি যে HMGA1 HLA-A এর α1 এবং α3 ডোমেনের সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করে, এর 3 DBD (চিত্র 5A, C) এর বাইরে বেশিরভাগ মিথস্ক্রিয়া।আমাদের হাতে, এইচএলএ-এ নিউক্লিয়াসে স্থানীয়করণ পাওয়া গেছে (ডেটা দেখানো হয়নি), এবং দেওয়া হয়েছে যে H2B এবং HMGA1 এছাড়াও নিউক্লিয়াসে উপস্থিত রয়েছে, এই মিথস্ক্রিয়া সম্ভবত নিউক্লিয়াসে ঘটে।H2B, HLA-A, এবং HMGA1 এর মধ্যে পরিমাপ করা নির্দিষ্ট অ্যাডাক্টগুলি চিত্র 5D এ দেখানো হয়েছে।
অন্যান্য প্রোটিনের সাথে HLA-A-এর বেশিরভাগ মিথস্ক্রিয়া এর α1 এবং α2 ডোমেন এবং বিকৃত সি-টার্মিনাল ডোমেনের মধ্যে ঘটে (চিত্র 6)।এই উদাহরণগুলির মধ্যে একটিতে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে এইচএলএ-এ LRCH4 (চিত্র 6A, D) এর বিকৃত এন-টার্মিনাল লেজের সাথে যোগাযোগ করে।LRCH4 TLR4 অ্যাক্টিভেশন এবং LPS সাইটোকাইন ইনডাকশন নিয়ন্ত্রণ করে, যার ফলে সহজাত ইমিউন প্রতিক্রিয়া 60,61 সংশোধন করে।এটি একটি মেমব্রেন প্রোটিন যার নয়টি লিউসিন-সমৃদ্ধ পুনরাবৃত্তি (LRRs) এবং একটি ক্যালমোডুলিন (CH) হোমোলজি মোটিফ এর ইক্টোডোমেনে রয়েছে, যার পরে একটি ট্রান্সমেমব্রেন ডোমেইন (TMD) 60, 62।সিএইচ ডোমেনগুলি প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া 60 মধ্যস্থতা করার জন্য রিপোর্ট করা হয়েছে।LRR এবং CH ডোমেনের মধ্যে প্রায় 300 অ্যামিনো অ্যাসিডের একটি প্রসারিত তুলনামূলকভাবে অ্যাক্সেসযোগ্য কিন্তু বিশৃঙ্খল।প্রোটিন-প্রোটিন নেটওয়ার্ক এবং ভেসিকুলার ট্রান্সপোর্ট 63 এর মধ্যস্থতাকারী হিসাবে বিশৃঙ্খল অঞ্চলগুলির কাজের উপর ভিত্তি করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে বেশিরভাগ প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া বিশৃঙ্খল অঞ্চলে ঘটে।MDN1 এর সাথে মিথস্ক্রিয়াগুলি LRR1, LRR6, CH ডোমেন এবং এলোমেলো অঞ্চল সহ প্রোটিনের দৈর্ঘ্য জুড়ে বিতরণ করা হয়েছিল, যখন H2B প্রধানত CH ডোমেনের সাথে আবদ্ধ (চিত্র 6A, B)।উল্লেখযোগ্যভাবে, মিথস্ক্রিয়াগুলির মধ্যে কোনওটিই টিএমজে অন্তর্ভুক্ত করেনি, যা CLMS পদ্ধতির নির্দিষ্টতার পরামর্শ দেয় (চিত্র 6A, B)।
MDN1 কে HLA-A প্রোটিন নেটওয়ার্কের অংশ হিসেবেও চিহ্নিত করা হয়েছে (চিত্র 6A)।এটি প্রোটিনের AAA পরিবারের অন্তর্গত (বিভিন্ন ক্রিয়াকলাপের সাথে যুক্ত এটিপিস)।এটি একই এন-টার্মিনাল AAA ডোমেন যা একটি হেক্সামেরিক রিংয়ে সংগঠিত হয় এবং 60S 64 রাইবোসোমাল সাবুনিট থেকে অ্যাসেম্বলি ফ্যাক্টরকে সরিয়ে দেয়।dynein64,65,66 এর অনুরূপ বলে মনে হচ্ছে।উপরন্তু, Asp/Glu সমৃদ্ধ অঞ্চল MIDAS ডোমেন (ধাতু আয়ন নির্ভর সাইট) দ্বারা অনুসরণ করা হয়।MDN1 এর বড় আকারের (প্রায় 5600 অ্যামিনো অ্যাসিড) এবং ভালভাবে অধ্যয়ন করা প্রোটিনের সাথে এর সীমিত হোমোলজির কারণে, মানুষের মধ্যে এর গঠন এবং কার্যকারিতা সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়।আমরা HLA-A, H2B, এবং LRCH4কে MDN1 বাইন্ডিং অংশীদার হিসাবে চিহ্নিত করেছি এবং PyMol (চিত্র 6A,B) এ প্রোটিন কমপ্লেক্স হিসাবে তাদের অভিযোজন প্রকাশ করেছি।এই তিনটি প্রোটিন AAA ডোমেইন, ডাইনিন-এর মতো লিঙ্কার ডোমেন এবং সম্ভবত MIDAS MDN1 ডোমেনের সাথে যোগাযোগ করে।পূর্ববর্তী একটি প্রতিবেদনে, টোপ প্রোটিনের অ্যাফিনিটি বিশুদ্ধকরণ MDN1 কে হিস্টোন H2B67 এর সাথে যুক্ত একটি প্রোটিন হিসাবে চিহ্নিত করেছে।এছাড়াও, একটি সাম্প্রতিক গবেষণায় আমাদের অনুসন্ধানগুলিকে সমর্থন করে, অ্যাফিনিটি-বিশুদ্ধ ভর স্পেকট্রোমেট্রি ব্যবহার করে HCT116 কোষে MDN এবং HLA-B-এর মধ্যে একটি মিথস্ক্রিয়াও রিপোর্ট করেছে।IFNα-চিকিত্সা করা নমুনাগুলিতে এই কমপ্লেক্সটির সনাক্তকরণ ইন্টারফেরন সিগন্যালিংয়ে MDN1 এর ভূমিকার পরামর্শ দেয়।
যেহেতু এইচএলএ জিনগুলি অত্যন্ত বহুরূপী, আমরা ফ্লো-1 কোষের আরএনএ সিকোয়েন্সিং ডেটা থেকে সিকোয়েন্সিং রিড ম্যাপিং এইচএলএ-এ, -বি এবং -সি বের করেছি (ডেটা দেখানো হয়নি)।সিকোয়েন্সিং রিডিংয়ের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ পেপটাইড সিকোয়েন্সগুলি HLA-A, -B, এবং -C এর মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ করেছে যেখানে ক্রস-লিঙ্কড পেপটাইডগুলি HLA-A (চিত্র S3) তে অবস্থিত ছিল।উপরন্তু, আমরা H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 প্রোটিনের সাথে HLA-B/C অণুর প্রোটিন-টু-প্রোটিন ক্রস-লিঙ্কিং পর্যবেক্ষণ করিনি।এটি পরামর্শ দেয় যে HLA-A, MDN1, LRCH1 এবং HMGA1 এর মধ্যে পাওয়া প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া HLA-A নির্দিষ্ট।উপরন্তু, নন-ক্রসলিঙ্কড নমুনাগুলির প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ (টেবিল এস 4) দেখায় যে HLA-A-এর HLA-B বা HLA-C এর তুলনায় উচ্চতর সিকোয়েন্স কভারেজ রয়েছে।এইচএলএ-এ-এর জন্য চিহ্নিত পেপটাইডগুলি IFNα-চিকিত্সা করা এবং চিকিত্সা না করা নমুনা উভয় ক্ষেত্রেই তীব্রতা বেশি ছিল।
এখানে চিহ্নিত মিথস্ক্রিয়াগুলি কাছাকাছি স্থানিক সান্নিধ্যে দুটি প্রোটিনের অ-নির্দিষ্ট ক্রস-লিঙ্কিংয়ের কারণে হয়নি তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা আরও দুটি নতুন এইচএলএ-এ ইন্টারঅ্যাক্টিং ফ্যাক্টরগুলি সহ-ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন অ্যাসেস সম্পাদন করে নিশ্চিত করেছি।অন্তঃসত্ত্বা MDN1 এবং H2B-এর সাথে HLA-A মিথস্ক্রিয়াগুলি IFNα-চিকিত্সা করা এবং চিকিত্সা না করা ফ্লো-1 কোষে (চিত্র 7, চিত্র S4) উভয় ক্ষেত্রেই সনাক্ত করা হয়েছিল।আমরা নিশ্চিত করেছি যে HLA-A কে H2B দ্বারা ইমিউনোপ্রিসিপিটেটে ধরা হয়েছিল এবং এই অ্যাসোসিয়েশনটি IFNα চিকিত্সার কারণে হয়েছিল যেহেতু HLA-A চিকিত্সাবিহীন কোষ থেকে ইমিউনোপ্রিসিপিটেট নমুনাগুলিতে অনুপস্থিত ছিল (চিত্র 7A)।যাইহোক, আমাদের ডেটা পরামর্শ দেয় যে IFNα আলাদাভাবে H2B এবং MDN1 এর সাথে HLA-A বাঁধাইকে নিয়ন্ত্রণ করে।IFNα H2B এবং HLA-A-এর মধ্যে অ্যাসোসিয়েশন প্ররোচিত করে, কিন্তু MDN1-এর সাথে এর সংযোগ হ্রাস করে।আমরা দেখেছি যে MDN1 নিয়ন্ত্রণে HLA-A-এর সাথে যুক্ত ছিল, এবং IFNα সংযোজন IFNα (চিত্র 7B,C) দ্বারা MDN1 আবেশ থেকে স্বাধীন এই মিথস্ক্রিয়াকে হ্রাস করেছে।উপরন্তু, এইচএলএ-এ ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন A549 কোষে H2B ধারণ করেছে (চিত্র S4), পরামর্শ দেয় যে এই মিথস্ক্রিয়াটি কোষের প্রকারের থেকে স্বাধীন।একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি H2B এবং MDN1 এর সাথে HLA-A-এর ইন্টারফেরন-মধ্যস্থ মিথস্ক্রিয়াকে সমর্থন করে।
HLA-A H2B এবং MDN1 সহ-শুদ্ধ করে।প্রতিনিধি অন্তঃসত্ত্বা H2B (A) এবং MDN1 (B) ইমিউনোব্লটগুলিকে IFNα-চিকিত্সা করা ফ্লো-1 কোষ থেকে ইমিউনোপ্রিসিপিটেট করা হয়েছিল এবং নির্দেশিত অ্যান্টিবডিগুলির জন্য অনুসন্ধান করা হয়েছিল।মাউস এবং খরগোশ আইজিজি একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।(সি) বিভিন্ন অ্যান্টিজেনের আপেক্ষিক পরিমাণ (ইনপুট) নির্দেশিত অ্যান্টিবডিগুলির বিরুদ্ধে অনুসন্ধান করা ইমিউনোব্লট দ্বারা চিত্রিত করা হয়েছে, β-অ্যাক্টিন একটি লোডিং নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।
ইন্টারফেরন-প্ররোচিত অত্যন্ত নির্ভরযোগ্য ক্রস-লিঙ্কযুক্ত নেটওয়ার্কগুলির মধ্যে একটির কাঠামোগত বৈশিষ্ট্যগুলি, H2B-HLA-A-HMGA1, তদন্ত করা হয়েছিল।এই জটিল (চিত্র 8) এর সাথে জড়িত প্রোটিনগুলির গঠনগত গতিবিদ্যা বোঝার জন্য আমরা একটি বিকল্প পদ্ধতি হিসাবে আণবিক গতিবিদ্যা মডেলিং ব্যবহার করেছি।CLMS ডেটা থেকে অনুমানগুলি H2B, HLA-A, এবং HMGA1 প্রোটিনের বিভিন্ন রূপের সম্ভাবনার পরামর্শ দেয়।অতএব, নিম্নলিখিত সম্ভাব্য কমপ্লেক্সগুলি একটি দ্রাবক মাধ্যমের মডেল করা হয়েছিল: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, এবং H2B-HLA-A-HMGA1।MOE (মলিকুলার অপারেটিং এনভায়রনমেন্ট; কেমিক্যাল কম্পিউটিং গ্রুপ ইনক., মন্ট্রিল, কুইবেক, কানাডা) প্যাকেজ ব্যবহার করে একটি প্রাথমিক প্রোটিন-প্রোটিন ডকিং স্ক্রিন সম্ভাব্য রূপের পরামর্শ দিয়েছে যা এই প্রোটিনের মধ্যে পার্থক্য রয়েছে (চিত্র 8A)।ডকিং প্রোটিন কমপ্লেক্সের ভিজ্যুয়ালাইজেশন বেশ কয়েকটি মিথস্ক্রিয়া এবং সম্ভাব্য গঠন প্রকাশ করেছে (চিত্র 5A, 8)।এইভাবে, চিত্র 8A (লেবেলযুক্ত ক্রস-লিঙ্ক সহ) একটি সম্ভাব্য গঠন দেখানো হয়েছে এবং এটি এমডি মডেলিং পাইপলাইন ব্যবহার করে আরও মূল্যায়ন করা হয়েছিল।উপরন্তু, H2B বা HMGA1-এর সাথে HLA-A-এর আবদ্ধতা HLA-A-এর জন্য H2B-এর উচ্চতর সখ্যতা তুলে ধরে (চিত্র 8A)।
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, এবং H2B-HLA-A-HMGA1 কমপ্লেক্সের মধ্যে সম্ভাব্য নেটওয়ার্কগুলির গঠনগত গতিবিদ্যা।(A) বাম প্যানেল হল একটি 2D মানচিত্র (সিম-এক্সএল সফ্টওয়্যারে তৈরি) ইন্ট্রামলিকুলার (লাল) এবং আন্তঃআণবিক (নীল) ক্রসলিঙ্কগুলির (ক্রসলিঙ্ক কাটঅফ 3.5 এ সেট করা হয়েছে)।উপরন্তু, চিহ্নিত ক্রস-লিংকিং অবশিষ্টাংশগুলি H2B, HLA-A, এবং HMGA1 প্রোটিনের কাঠামোর উপর লেবেলযুক্ত।MOE প্যাকেজে বাস্তবায়িত ডকিং পাইপলাইন ব্যবহার করে এই প্রোটিনগুলির সম্পর্কিত রূপগুলি বের করা হয়েছিল।নীচের বাম প্যানেলটি বিভিন্ন প্রোটিন-প্রোটিন বাইন্ডিং অ্যাফিনিটি (GBVI/WSA dG; kcal/mol) সহ H2B-HLA-A এবং HMGA1-HLA-A কমপ্লেক্সের বিভিন্ন সম্ভাব্য রূপগুলি দেখায়।(B) প্রতিটি প্রোটিন গঠনের জন্য পারমাণবিক অবস্থানের (হাইড্রোজেন পরমাণু ব্যতীত) স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি (RMSD)।(C) আন্তঃআণবিক প্রোটিন-প্রোটিন হাইড্রোজেন বন্ড মিথস্ক্রিয়া বিভিন্ন সিমুলেটেড কমপ্লেক্স থেকে নির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়া ≥ 10 ns সময়কাল বিবেচনা করে।এইচ-বন্ড দাতা-গ্রহণকারী কাটঅফ দূরত্ব 3.5 Å সেট করা হয়েছিল এবং দাতা-এইচ-গ্রহণকারী কাটঅফ কোণটি ≥ 160°–180° সেট করা হয়েছিল৷(D) লেবেলযুক্ত অবশিষ্টাংশগুলি তাদের নিজ নিজ অংশীদারদের সাথে HLA-A প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া গঠন করে, ≥ 20 ns বিস্তৃত, ডামি HLA-A-H2B এবং HLA-A-HMGA1 কমপ্লেক্স থেকে বের করা।প্রোটিন স্ট্রাকচার 100 এনএস এমডিএসের গড় গঠন উপস্থাপন করে।(E) HLA-A-H2B এবং HLA-A-HMGA1 কমপ্লেক্সের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া দুটি পেপটাইডের মধ্যে K বা S ইন্টারঅ্যাকশন সাইটের উপর ভিত্তি করে 100 এনএসের বেশি H2B-HLA সিমুলেশন দ্বারা ট্র্যাক করা মিথস্ক্রিয়াগুলির তুলনায়।কমপ্লেক্স /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1।ক্রস-লিঙ্কগুলির মূল্যায়নের জন্য থ্রেশহোল্ড মান 3.0 তে সেট করা হয়েছিল, এবং MDS থেকে ≥ 10 ns নেওয়ার নির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়াগুলি বিবেচনায় নেওয়া হয়েছিল।BIOVIA ডিসকভারি স্টুডিও (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) এবং মলিকুলার অপারেটিং এনভায়রনমেন্ট (MOE; কেমিক্যাল কম্পিউটিং গ্রুপ ইনক., মন্ট্রিল, ক্যুবেক, কানাডা) প্যাকেজগুলি ব্যবহার করে প্রোটিন কাঠামোগুলি কল্পনা করা হয়েছিল।
সময়ের সাথে সাথে HLA-A অণুর স্থায়িত্ব (স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন; RMSD বা স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন; RMSF) নির্দেশ করে যে কমপ্লেক্সে H2B বা HMGA1 প্রোটিনের উপস্থিতি HLA-A (চিত্র 8B, চিত্র S5) স্থিতিশীল করে।HMGA1 প্রোটিন HLA-A-এর B2M সাইটে শক্তভাবে আবদ্ধ হয়, HLA-A-HMGA1 বা H2B-HLA-A-HMGA1 কমপ্লেক্সে HLA-A অ্যামিনো অ্যাসিডের স্থায়িত্বকে প্ররোচিত করে (চিত্র 8B, চিত্র S5)।বিশেষ করে, HLA অবশিষ্টাংশ ~60-90 এবং ~180-210 H2B (FIG. 8B) এর উপস্থিতিতে কম নমনীয় ছিল।H2B এবং HMGA1 H2B-HLA-A-HMGA1 কমপ্লেক্সে HLA-A-এর সাথে একা H2B বা HMGA1-এর সাথে আবদ্ধ হওয়ার তুলনায় HLA-A-এর সাথে আরও ভাল আবদ্ধতা দেখিয়েছে (চিত্র 8C, D; টেবিল S5)।হাইড্রোজেন বন্ধনের সাথে জড়িত অবশিষ্টাংশগুলি (MD মডেলের উচ্চ দখল ≥ 10 ns) কমপ্লেক্সে CLMS ইন্টারঅ্যাকশন সাইটগুলির (K বা S অবশিষ্টাংশ) সাথে মিলে যায়, পরামর্শ দেয় যে CLMS দ্বারা চিহ্নিত মিথস্ক্রিয়াগুলি অত্যন্ত নির্ভরযোগ্য।নির্ভরযোগ্যতা (চিত্র 8ই)।CLMS এবং MD মডেলিং-এ, প্রায় 190-210 এবং প্রায় 200-220 অ্যামিনো অ্যাসিডের মধ্যে HLA-A অবশিষ্টাংশগুলি যথাক্রমে H2B এবং HMGA1 আবদ্ধ করতে পাওয়া গেছে (FIG. 8E)।
প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া গতিশীল স্ট্রাকচারাল নেটওয়ার্ক গঠন করে যা নির্দিষ্ট উদ্দীপনার প্রতিক্রিয়ায় অন্তঃকোষীয় যোগাযোগের মধ্যস্থতা করে।যেহেতু অনেক প্রোটিওমিক্স পন্থা একটি প্রোটিনের সামগ্রিক স্থির অবস্থার স্তরের পরিবর্তনগুলি সনাক্ত করে, প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া গতিবিদ্যার জন্য বাইন্ডিং ইন্টারফেসগুলি ক্যাপচার করার জন্য অতিরিক্ত সরঞ্জামের প্রয়োজন হয় এবং CLMS হল সেইরকম একটি টুল।ইন্টারফেরন সিগন্যালিং সিস্টেম হল একটি সাইটোকাইন নেটওয়ার্ক যা কোষগুলিকে পরিবেশগত প্যাথোজেনিক এবং অভ্যন্তরীণ প্যাথলজিক্যাল সিগন্যালের একটি পরিসরে প্রতিক্রিয়া জানাতে দেয়, যা ইন্টারফেরন-ইন্ডুসিবল প্রোটিনের উপসেটগুলির আবেশে পরিণত হয়।ইন্টারফেরন-প্ররোচিত প্রোটিনের একটি প্যানেলের মধ্যে অভিনব প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া সনাক্ত করা যায় কিনা তা নির্ধারণ করতে আমরা CLMS প্রয়োগ করেছি।একটি ইন্টারফেরন-প্রতিক্রিয়াশীল ফ্লো -1 সেল মডেলে গ্লোবাল প্রোটিন ক্রস-লিঙ্কিং বিশ্লেষণ প্রোটিন কমপ্লেক্সগুলি ক্যাপচার করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।নন-ক্রস-লিঙ্কড এবং ক্রস-লিঙ্কড কোষ থেকে ট্রিপটিক পেপটাইড নিষ্কাশন পেপটাইড গণনা, পাথওয়ে সমৃদ্ধকরণ, এবং সংজ্ঞায়িত LFQ তীব্রতার সাথে পেপটাইড দৈর্ঘ্য বিতরণের অনুমতি দেয়।ক্যানোনিকাল ইন্টারফেরন-ইনডুসিবল প্রোটিনগুলিকে একটি ইতিবাচক অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল, যখন MX1, UP18, OAS3 এবং STAT1 এর মতো ক্যানোনিকাল ইন্টারফেরন-ইনডুসিবল প্রোটিনের নতুন আন্তঃআণবিক এবং ইন্ট্রামলিকুলার ক্রস-লিঙ্কড অ্যাডাক্টগুলি পরিলক্ষিত হয়েছিল।কার্যকরী এলাকায় বিভিন্ন কাঠামোগত বৈশিষ্ট্য এবং মিথস্ক্রিয়া তদন্ত করা হয়েছে।
HLA-A, MDN1 এবং H2B-এর মধ্যে একটি মিথস্ক্রিয়া Flo-1 এবং A549 কোষে ইমিউনোব্লটিং দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল যেগুলি IFNα এর সাথে চিকিত্সা করা হয়েছে এবং চিকিত্সা করা হয়নি।আমাদের ফলাফলগুলি হাইলাইট করে যে HLA-A কমপ্লেক্স H2B এর সাথে IFNα-নির্ভর পদ্ধতিতে।আমাদের কাজ এই দুটি কমপ্লেক্সের সহ-স্থানীয়করণের আরও অন্বেষণের জন্য একটি আকর্ষণীয় উপায় উপস্থাপন করে।সেল-টাইপ-স্বাধীন ইন্টারফেরন-মধ্যস্থ প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া সনাক্ত করতে সেল লাইনের একটি প্যানেলে CLMS পদ্ধতির প্রসারিত করাও আকর্ষণীয় হবে।অবশেষে, আমরা H2BFS-HLA-A-HMGA1 কমপ্লেক্সে জড়িত প্রোটিনগুলির গঠনগত গতিবিদ্যা বোঝার জন্য একটি বিকল্প পদ্ধতি হিসাবে MD মডেলিং ব্যবহার করেছি, যা ইন্ট্রামলিকুলার এবং আন্তঃআণবিক ক্রস-টক ট্র্যাক করে।CLMS ডেটা থেকে অনুমানগুলি H2BFS, HLA-A, এবং HMGA1 প্রোটিনের বিভিন্ন রূপের সম্ভাবনার পরামর্শ দেয়।এই ডকিং প্রোটিন কমপ্লেক্সগুলির মধ্যে সম্ভাব্য বিভিন্ন রূপান্তরগুলি সিএলএমএস ডেটাসেটে পর্যবেক্ষণের মতো বেশ কয়েকটি মিথস্ক্রিয়া প্রকাশ করেছে।আমাদের পদ্ধতির একটি প্রধান শক্তি হল যে এটি HLA-এর মতো অত্যন্ত পলিমরফিক জিনগুলির মিথস্ক্রিয়াকে সহজে সনাক্ত করার অনুমতি দেয়, তাই এইচএলএ হ্যাপ্লোটাইপ-নির্দিষ্ট প্রোটিনের মিথস্ক্রিয়াগুলি অধ্যয়ন করা আকর্ষণীয় হবে যা অন্যথায় অধ্যয়ন করা কঠিন।একসাথে নেওয়া, আমাদের ডেটা দেখায় যে CLMS ইন্টারফেরন-প্ররোচিত সিগন্যালিং নেটওয়ার্কগুলির আমাদের বোঝার প্রসারিত করতে এবং টিউমার মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে আরও জটিল আন্তঃকোষীয় সিস্টেমগুলি অধ্যয়নের জন্য একটি ভিত্তি প্রদান করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।
ফ্লো-1 কোষগুলি ATCC থেকে প্রাপ্ত করা হয়েছিল এবং DMEM (Gibco) তে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল 1% পেনিসিলিন/স্ট্রেপ্টোমাইসিন (ইনভিট্রোজেন), 10% ভ্রূণের বোভাইন সিরাম (Gibco) দিয়ে এবং 37°C এবং 5% CO2 এ সংরক্ষণ করা হয়েছিল।ইনকিউবেশন।IFNα14 (এডিনবার্গ প্রোটিন উত্পাদন সুবিধা দ্বারা নির্মিত) এর সাথে চিকিত্সা করার আগে কোষগুলিকে 70-80% সঙ্গমে পরিণত করা হয়েছিল।অন্যান্য সমস্ত রাসায়নিক এবং বিকারক সিগমা অ্যালড্রিচ থেকে কেনা হয়েছিল যদি না অন্যথায় উল্লেখ করা হয়।
Flo-1 কোষগুলিকে 6-ওয়েল প্লেটে সংষ্কৃত করা হয়েছিল এবং পরের দিন কোষগুলিকে 10 ng/ml IFNα14 দিয়ে 24 ঘন্টার জন্য প্রায় 80% সঙ্গমে চিকিত্সা করা হয়েছিল।কোষগুলিকে পিবিএস দিয়ে তিনবার ধৌত করা হয়েছিল এবং 0.5 মিমি চূড়ান্ত ঘনত্বের জন্য 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 5 মিনিটের জন্য পিবিএস-এ সদ্য প্রস্তুত ডিএসএস (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) (ডিএমএসওতে দ্রবীভূত) দিয়ে আটকানো হয়েছিল।ডিএসএস ক্রসলিংকিং প্রতিক্রিয়াটি পিবিএস দিয়ে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 15 মিনিটের জন্য পিবিএস-এ 20 মিমি ট্রিস (পিএইচ 8.0) যোগ করে অবশিষ্ট ডিএসএস নিভিয়ে দেওয়া হয়েছিল।কোষগুলি স্ক্র্যাপ করে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং কম বাঁধাই টিউবগুলিতে (অ্যাক্সিজেন) সংগ্রহ করা হয়েছিল।
সেল পেলেটটি 300 μl ইউরিয়া লাইসিস বাফার (8 এম ইউরিয়া, 0.1 এম ট্রিস, পিএইচ 8.5) দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য মাঝে মাঝে ঝাঁকুনি দিয়ে লাইজ করা হয়েছিল।সমস্ত সেন্ট্রিফিউগেশন পদক্ষেপগুলি 14,000 xg এ 8 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সঞ্চালিত হয়েছিল।10 মিনিটের জন্য লাইসেটকে সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং সুপারনাট্যান্টটিকে একটি নতুন টিউবে স্থানান্তর করুন।অবশিষ্ট পরিষ্কার কণাগুলি দ্বিতীয় লিসিস বাফারের 150 μl (2 M ইউরিয়া, 2% (w/v) SDS (সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেট)) 30 মিনিট বা তার বেশি সময়ের জন্য দ্রবীভূত করা হয়েছিল যতক্ষণ না একটি সমজাতীয় জলীয় দ্রবণ প্রাপ্ত হয়।লাইসেটটি 20 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং পূর্ববর্তী ধাপে প্রাপ্ত লাইসেটের সাথে সুপারনাট্যান্ট মিশ্রিত হয়েছিল।মাইক্রোপ্লেট পদ্ধতির জন্য প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে মাইক্রো বিসিএ অ্যাস (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে প্রোটিনের ঘনত্বের মূল্যায়ন করা হয়েছিল।নমুনাগুলি দ্রুত তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত করা হয়েছিল এবং -80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
প্রায় 100 μg দ্রবণীয় ক্রস-লিঙ্কযুক্ত প্রোটিন একটি পরিবর্তিত পরিস্রাবণ নমুনা প্রস্তুতি প্রোটোকল (FASP) ব্যবহার করে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল যেমনটি Wisniewski et al দ্বারা বর্ণিত হয়েছে।69 সংক্ষেপে, প্রোটিনটি 200 μl ইউরিয়া বাফার (0.1 M Tris-এ 8 M ইউরিয়া, pH 8.5), ঘূর্ণি এবং অর্ধেক এর সাথে সংযুক্ত।সমস্ত সেন্ট্রিফিউগেশন পদক্ষেপগুলি 25 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 14,000 xg এ সঞ্চালিত হয়েছিল।ক্রস-লিঙ্কযুক্ত প্রোটিন লাইসেটের প্রথমার্ধটি একটি 10 ​​kDa মাইক্রোকন সেন্ট্রিফিউগাল ফিল্টার ডিভাইসে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল যা একটি Ultracel-10 মেমব্রেন (Merck) দিয়ে সজ্জিত করা হয়েছিল, তারপরে 25 মিনিটের জন্য ফিল্টারে কেন্দ্রীভূতকরণ করা হয়েছিল।তারপর ফিল্টারে প্রোটিনের দ্বিতীয় অর্ধেক যোগ করুন এবং একই পদক্ষেপগুলি পুনরাবৃত্তি করুন।ইউরিয়া বাফারে 100 μl 17 মিমি ট্রিস (2-কারবক্সাইথাইল) ফসফাইন হাইড্রোক্লোরাইড (টিসিইপি) যোগ করে প্রোটিন পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল।37°C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য 600 rpm-এ একটি থার্মোমিক্সারে পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল।এছাড়াও, কলামটি সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং ইউরিয়া বাফারে 100 μl 50 মিমি আয়োডোসেটামাইড ব্যবহার করে হ্রাসকৃত ক্রস-লিঙ্কযুক্ত প্রোটিনকে অ্যালকিলেট করা হয়েছিল।অন্ধকারে 20 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় অ্যালকিলেশন প্রতিক্রিয়া চালানো হয়েছিল।কলামটি ঘোরান, 100 μl ইউরিয়া বাফার দিয়ে কলামের দেয়াল 3 বার ধুয়ে নিন এবং তারপর সেন্ট্রিফিউজ করুন।100 মিমি অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেটের 100 μl ব্যবহার করে একই অপারেশনটি 3 বার করা হয়েছিল।ট্রিপসিনাইজেশনের আগে, সংগ্রহের টিউবটি একটি নতুন দিয়ে প্রতিস্থাপন করুন।50 মিমি অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট এবং ট্রিপসিন বাফারে (প্রোমেগা) মিশ্রিত 1 μl ট্রিপসিন ধারণকারী হজম বাফার যোগ করুন।ট্রিপসিনের সাথে প্রোটিনের অনুপাত প্রায় 1:33 এ বজায় রাখা হয়েছিল, এবং হজম প্রতিক্রিয়াগুলি একটি আর্দ্র চেম্বারে 37° সেন্টিগ্রেডে রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল।ক্রসলিঙ্কড পেপটাইড 25 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা ফিল্টার থেকে নির্গত হয়েছিল।ফিল্টারে 50 μl 0.5 M NaCl যোগ করে পেপটাইড পুনরুদ্ধার উন্নত করা হয়েছিল, তারপরে 25 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন।
C18 মাইক্রো স্পিন কলামগুলি (হার্ভার্ড যন্ত্রপাতি) ব্যবহার করা হয়েছিল ক্রস-লিঙ্কড ট্রিপটিক পেপটাইডগুলিকে ডিসল্ট করার জন্য বাউচাল এট আল.70 দ্বারা বর্ণিত প্রোটোকল অনুসরণ করে ছোটখাটো পরিবর্তনের সাথে।সংক্ষেপে, C18 স্পিন কলাম অ্যাসিটোনিট্রিল (AcN) (Merck) এ 0.1% ফরমিক অ্যাসিড (FA) এর তিনটি ওয়াশ এবং 0.1% FA এর দুটি ওয়াশ দিয়ে সক্রিয় করা হয়েছিল।15 মিনিটের জন্য কলামটি 0.1% FA দিয়ে হাইড্রেটেড ছিল।স্পিন কলামে নমুনা লোড করুন এবং 0.1% FA দিয়ে 3 বার ধুয়ে ফেলুন।ডিসল্ট করা পেপটাইডগুলিকে 0.1% FA-তে 50%, 80% এবং 100% AcN ব্যবহার করে ধাপে ধাপে গ্রেডিয়েন্টের সাথে ক্রমাগতভাবে নির্গত করা হয়েছিল।অবশিষ্ট তরল সম্পূর্ণরূপে অদৃশ্য না হওয়া পর্যন্ত নমুনাগুলি একটি স্পিডভ্যাক প্লাস কনসেনট্রেটরে (এপেনডর্ফ) শুকানো হয়েছিল।এলুটেড পেপটাইডগুলি 0.08% ট্রাইফ্লুরোএসেটিক অ্যাসিডের 100 μl 2.5% AcN-এ দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং ঘনত্ব একটি NanoDrop 2000 (থার্মো সায়েন্টিফিক) এ পরিমাপ করা হয়েছিল।প্রতি নমুনায় প্রায় 1 μg ক্রসলিংকড পেপটাইড এলসি-এমএস/এমএস সিস্টেমে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।
অরবিট্র্যাপ এক্সপ্লোরিস 480 ভর স্পেকট্রোমিটার (থার্মো সায়েন্টিফিক) এর সাথে সংযুক্ত একটি UltiMate 3000 RSLCnano LC সিস্টেমে (থার্মো সায়েন্টিফিক) ক্রস-লিঙ্কড পেপটাইডগুলি আলাদা করা হয়েছিল।ক্রস-লিঙ্কড পেপটাইডগুলি একটি 300 µm আইডিতে সংগ্রহ করা হয়েছিল, 5 মিমি দীর্ঘ µ-প্রি-কলাম C18 ক্যাপচার কলামে C18 PepMap100 সরবেন্ট এবং 5 µm পেপম্যাপ সরবেন্ট (থার্মো সায়েন্টিফিক) দিয়ে প্যাক করা হয়েছিল।5 μl/মিনিট 0.08% ট্রাইফ্লুরোঅ্যাসেটিক অ্যাসিড 2.5% AcN দ্রবীভূত করা পাম্প প্রবাহ সেট লোড করুন।ক্রস-লিঙ্কযুক্ত পেপটাইডগুলি 75 μm এর অভ্যন্তরীণ ব্যাস এবং 150 মিমি দৈর্ঘ্যের একটি বিশ্লেষণাত্মক ফিউজড সিলিকা কলামে পৃথক করা হয়েছিল, একটি 2 μm পেপম্যাপ সরবেন্ট (থার্মো সায়েন্টিফিক) দিয়ে ভরা।মোবাইল ফেজ A এবং B-এ যথাক্রমে 0.1% FA জলে এবং 0.1% FA অ্যাসিটোনিট্রিলে থাকে।গ্রেডিয়েন্টটি 2.5% B থেকে শুরু হয় এবং 90 মিনিটের মধ্যে 40% B পর্যন্ত রৈখিকভাবে বৃদ্ধি পায়, তারপর পরবর্তী 2 মিনিটে 90% B পর্যন্ত।মোবাইল ফেজ কম্পোজিশন 90% B-তে 10 মিনিটের জন্য বজায় রাখা হয়েছিল এবং তারপর 2 মিনিটের মধ্যে রৈখিকভাবে 2.5% B-এ হ্রাস পেয়েছে।পরবর্তী চক্রের আগে 8 মিনিটের জন্য কলামটি 2.5% B তে ভারসাম্যপূর্ণ ছিল।বিশ্লেষণাত্মক কলাম থেকে নির্গত ক্রস-লিঙ্কড পেপটাইডগুলিকে একটি ন্যানোইলেক্ট্রসপ্রে আয়নাইজেশন (এনএসআই) উত্সে আয়নিত করা হয়েছিল এবং একটি এক্সপ্লোরিস 480 ভর স্পেকট্রোমিটারে (থার্মো সায়েন্টিফিক) ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।
অরবিট্র্যাপ এক্সপ্লোরিস 480 ভর স্পেকট্রোমিটার ইতিবাচক ডেটা পারস্পরিক সম্পর্ক মোডে কাজ করে।m/z 350 Th থেকে m/z 2000 Th রেঞ্জ সেটিংস সহ 120,000 রেজোলিউশনে বিভাগ মোডে একটি সম্পূর্ণ স্ক্যান করা হয়েছিল।50ms এর সর্বাধিক ইনপুট সময় সহ স্বাভাবিক AGC লক্ষ্য 300% এ সেট করা হয়েছিল।পেপটাইডের জন্য মনোআইসোটোপিক পিক সনাক্তকরণ প্রতিষ্ঠিত হয়েছে।সীমাবদ্ধতা শিথিলকরণ প্যারামিটারটি সত্য হিসাবে সেট করা হয় যদি খুব কম অগ্রদূত পাওয়া যায়।পূর্বসূরীর সর্বনিম্ন আয়নিক শক্তি 5.0e3 সেট করা হয়েছিল এবং +8 পর্যন্ত পূর্ববর্তী চার্জের অবস্থাগুলি পরীক্ষায় অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল।
ডেটা পারস্পরিক সম্পর্ক মোডে প্রধান স্ক্যানগুলির মধ্যে চক্রের সময় 2.5 সেকেন্ডে সেট করা হয়েছিল।গতিশীল ভর বর্জন পূর্বসূর আয়নের প্রথম খণ্ডিতকরণের পরে 20 সেকেন্ডে সেট করা হয়েছিল।পূর্ববর্তী বিচ্ছিন্নতা উইন্ডোটি 2 তম সেট করা হয়েছিল৷একটি নির্দিষ্ট সংঘর্ষ শক্তি মোড সহ স্বাভাবিক সংঘর্ষ শক্তির ধরনটি ডেটা নির্ভর MS/MS স্ক্যানে বেছে নেওয়া হয়েছিল।সংঘর্ষ শক্তি 30% এ সেট করা হয়েছে।অরবিট্র্যাপ রেজোলিউশন 15,000 এবং AGC লক্ষ্য 100% নির্ধারণ করা হয়েছিল৷কাস্টম সর্বোচ্চ ইনজেকশন সময় 60 মিলিসেকেন্ডে সেট করা হয়েছে।
ক্রস-লিঙ্কযুক্ত নমুনাগুলিতে প্রোটিন-প্রোটিন নেটওয়ার্ক ট্র্যাক করার আগে, আমরা নমুনাগুলিতে সনাক্তযোগ্য পেপটাইড/প্রোটিন সনাক্ত করতে MaxQuant প্যাকেজ (সংস্করণ 1.6.12.0) 26,27 ব্যবহার করে কাঁচা ফাইলগুলি প্রক্রিয়া করেছি।উপরন্তু, অনুরূপ প্রোটিওমিক বিশ্লেষণগুলি IFNα এর সাথে চিকিত্সা করা এবং চিকিত্সা না করা আনক্রসলিঙ্কড ফ্লো-1 নমুনাগুলিতে সঞ্চালিত হয়েছিল।অন্তর্নির্মিত সার্চ ইঞ্জিন Andromeda27 ব্যবহার করে MS/MS ডেটা UniProt হিউম্যান ডাটাবেসে (www.uniprot.org) (12 আগস্ট, 2020 আপলোড করা হয়েছে, এতে 75,093টি এন্ট্রি রয়েছে) অনুসন্ধান করা হয়েছে।অনুসন্ধানটি এনজাইমের নির্দিষ্টতা এবং ডেমিডেশন (এন, কিউ) এবং অক্সিডেশন (এম) এর বিভিন্ন পরিবর্তনগুলি নির্দেশ না করেই চালানো হয়েছিল।পূর্ববর্তী ভর সহনশীলতা 20 পিপিএম এবং পণ্য আয়ন 0.02 Da এ সেট করা হয়েছিল।প্রাথমিক এবং সর্বাধিক ভর বিচ্যুতি 10 পিপিএম সেট করা হয়েছিল।পেপটাইডের সর্বোচ্চ ভর 4600 Da এ সেট করা হয়েছিল এবং অনুক্রমের সাদৃশ্যটি 7 থেকে 25 অ্যামিনো অ্যাসিড (aa) এর মধ্যে সেট করা হয়েছিল।পার্সিয়াস প্রোগ্রাম (সংস্করণ 1.6.10.45) ব্যবহার করে আরও পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।প্রোটিনের কন্টেন্ট প্রোটিনের বর্ণালী তীব্রতা (LFQ তীব্রতা; লেবেলবিহীন পরিমাণ নির্ধারণ)27 স্বাভাবিক করে গণনা করা হয়েছিল এবং তীব্রতার মানগুলি Log2 এ রূপান্তরিত হয়েছিল।পেপটাইডের তীব্রতা দ্বারা চিহ্নিত প্রোটিনগুলির একটি শ্রেণিবদ্ধ ক্লাস্টারিং R (v 4.1.2) তে ফিটম্যাপ (v1.0.12) প্যাকেজ ব্যবহার করে নির্মিত হয়েছিল।পাথওয়ে সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণটি IFNα-চিকিত্সা করা প্রোটিনের জন্য রিঅ্যাক্টোম পাথওয়ে ডাটাবেস ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল যা চিকিত্সা না করা নমুনার তুলনায় চার গুণেরও বেশি সক্রিয় ছিল।
এলসি-এমএস/এমএস দ্বারা নিরীক্ষণ করা প্রোটিন কমপ্লেক্সের লাইসিন (কে) বা সেরিন (এস) নির্দিষ্ট রাসায়নিক ক্রসলিঙ্কগুলির সনাক্তকরণ ক্রস-লিঙ্কযুক্ত পেপটাইডস (সিম-এক্সএল) 29 এর জন্য একটি স্পেকট্রোস্কোপিক সনাক্তকরণ মেশিন (সিম-এক্সএল) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।প্রথমত, ইন্টারফেরন-সম্পর্কিত (IFN) DNA ক্ষতি প্রতিরোধের স্বাক্ষর (IRDS) জিনের মধ্যে সম্ভাব্য মিথস্ক্রিয়াগুলি Padariya et al.28-এ বর্ণিত IRDS প্রোটিন ডেটাসেট ব্যবহার করে তদন্ত করা হয়েছিল।সমগ্র মানব UniProt-এর সমস্ত অবস্থা এবং পুনরাবৃত্তির স্ক্রীনিং গণনামূলকভাবে নিবিড়, তাই সমগ্র মানব UniProt ডাটাবেস (www.uniprot.org) (ডাউনলোড 12 আগস্ট 2020, 75,093টি এন্ট্রি রয়েছে) IFNα-চিকিত্সা করা পুনরাবৃত্তির বিরুদ্ধে।উচ্চ বিশ্বাস মিথস্ক্রিয়া জন্য ফিল্টার এক.প্রাপ্ত এই উচ্চ-গুরুত্বপূর্ণ মিথস্ক্রিয়াগুলি সমস্ত পুনরাবৃত্তি এবং শর্তে প্রসারিত এবং পরীক্ষা করা হয়েছিল।
সিম-এক্সএল-এ, ক্রসলিংকার (এক্সএল) এর জন্য ডিএসএস ব্যবহার করা হয়েছিল এবং এক্সএল ওজন স্থানান্তর এবং পরিবর্তন ওজন শিফট যথাক্রমে 138.06 এবং 156.07 এ সেট করা হয়েছিল।নিম্নলিখিত ক্রসলিংকিং প্রতিক্রিয়া সাইটগুলি বিবেচনা করা হয়: KK, KS এবং KN-TERM, রিপোর্টার আয়ন ছাড়া।পূর্ববর্তী এবং খণ্ড পিপিএম উভয়ই 20 এ সেট করা হয়েছিল এবং Xrea থ্রেশহোল্ড 0.15 এ সেট করা হয়েছিল।ট্রিপসিনকে সম্পূর্ণ নির্দিষ্ট বলে মনে করা হয়েছিল এবং একটি উচ্চ-শক্তি সি-ট্র্যাপ (এইচসিডি) ফ্র্যাগমেন্টেশন পদ্ধতি প্রয়োগ করা হয়েছিল।XCorr গতিশীল DB হ্রাস থ্রেশহোল্ড এবং গতিশীল DB হ্রাসের জন্য পেপটাইডের ন্যূনতম সংখ্যা যথাক্রমে 2.5 এবং 2 সেট করা হয়েছিল।অন্যান্য পরামিতিগুলি হল: মনোইসোটোপ সম্ভাব্যতা এবং সর্বোচ্চ কাকতালীয় কাটঅফ, প্রতি স্ট্র্যান্ডে সর্বনিম্ন 4 AA অবশিষ্টাংশ এবং সর্বাধিক স্ট্র্যান্ড চার্জ এবং মিসড স্প্লিটের 3টি সর্বোচ্চ।ফলস্বরূপ সেলাই করা 2D মানচিত্রগুলি (SIM-XL) এ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং xQuest28 গ্রাফিকাল উপস্থাপনা 2D মানচিত্র তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।প্রোটিন স্ট্রাকচারের প্রোটিন ক্রসলিঙ্কগুলি পাইমল (PyMOL মলিকুলার গ্রাফিক্স সিস্টেম, সংস্করণ 2.0 শ্রোডিঙ্গার, এলএলসি) এ সরবরাহ করা হয়েছে।
প্রোটিন মডেল স্ট্রাকচারগুলি Phyre2 সার্ভার (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল হোমোলজি মডেলিং এবং "হিডেন মার্কভ মেথড" এর বাস্তবায়নের নীতিগুলি ব্যবহার করে।Phyre2 পরিচিত প্রোটিন কাঠামোর সাথে ক্রম প্রান্তিককরণের উপর ভিত্তি করে মডেল কাঠামো তৈরি করে।H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, এবং MDN1 প্রোটিনের জন্য, টেমপ্লেট কাঠামো 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, এবং 6i2665 ব্যবহার করা হয়েছিল।এছাড়াও, AlphaFold71 MX1, UBP18 এবং ROBO1 এর গঠনও বিবেচনা করা হয়েছিল।প্রোটিন গঠনটি BIOVIA ডিসকভারি স্টুডিও ভিজ্যুয়ালাইজার প্যাকেজ (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) এবং মলিকুলার অপারেটিং এনভায়রনমেন্ট প্যাকেজ (MOE; কেমিক্যাল কম্পিউটিং গ্রুপ ইনক., মন্ট্রিল, ক্যুবেক, কানাডা) ব্যবহার করে কল্পনা করা হয়েছিল।