ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 রাসায়নিক শিল্প রাসায়নিক উপাদানের জন্য ডুপ্লেক্স ওয়েল্ডেড টিউব, SPECC1L এর ঘাটতি বিভক্ত জয়েন্টগুলির স্থিতিশীলতা বৃদ্ধি করে এবং ক্র্যানিয়াল নিউরাল ক্রেস্ট কোষগুলির হ্রাস হ্রাস করে।

Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি সীমিত CSS সমর্থন সহ একটি ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করছেন।সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷উপরন্তু, চলমান সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়া সাইট দেখাই।

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 রাসায়নিক শিল্পের জন্য ডুপ্লেক্স ওয়েল্ডেড টিউব

লিয়াওচেং সিহে এসএস মেটেরিয়াল কোং, লিমিটেড।একটি নেতৃস্থানীয় প্রস্তুতকারক যিনি স্টেইনলেস স্টীল বিজোড় পাইপ, উজ্জ্বল annealed টিউব, বিজোড় কয়েলড টিউবিং ইত্যাদিতে বিশেষজ্ঞ।গ্রাহকদের সুবিধার্থে, আমরা পাইপ এবং টিউবও ঢালাই করেছি।লিয়াওচেং সিহে এসএস মেটেরিয়াল কোং, লিমিটেড।সবচেয়ে উন্নত উত্পাদন এবং পরীক্ষার সরঞ্জাম আছে.আমরা সম্পূর্ণরূপে আপনার প্রয়োজনীয়তা সন্তুষ্ট করতে পারেন.খুব কঠোরভাবে মান অনুযায়ী, আমাদের দ্বারা উত্পাদিত টিউবগুলির সর্বদা সঠিক OD এবং WT সহনশীলতা থাকে।সহনশীলতা নিয়ন্ত্রণ কঠোরভাবে মান উত্পাদন অনুযায়ী হয়.আমাদের পণ্য সবসময় গ্রাহকদের সঙ্গে সন্তুষ্ট হয়.গ্রাহকরা আমাদের পণ্য ক্রয় আরো লাভ তৈরি.
ক) OD (বাহ্যিক ব্যাস): 3.18 মিমি থেকে 101.6 মিমি
খ) WT ( দেয়ালের বেধ): 0.5 মিমি থেকে 20 মিমি
গ) দৈর্ঘ্য: গ্রাহকের প্রয়োজন অনুযায়ী
d) মান : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ইত্যাদি
e) প্রক্রিয়া পদ্ধতি: ERW, EFW ইত্যাদি

স্লাইডার প্রতি স্লাইডে তিনটি নিবন্ধ দেখাচ্ছে৷স্লাইডগুলির মধ্য দিয়ে যেতে পিছনে এবং পরবর্তী বোতামগুলি ব্যবহার করুন, অথবা প্রতিটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যাওয়ার জন্য শেষে স্লাইড কন্ট্রোলার বোতামগুলি ব্যবহার করুন৷
ক্র্যানিয়াল নিউরাল ক্রেস্ট কোষ (CNCC) ভ্রূণের স্নায়ু ভাঁজগুলিকে ছিন্ন করে এবং ফ্যারিঞ্জিয়াল আর্চে স্থানান্তরিত করে, যা বেশিরভাগ মধ্যমুখী কাঠামো গঠন করে।CNCC কর্মহীনতা ওরোফেসিয়াল ক্লেফটের এটিওলজিতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, এটি একটি সাধারণ জন্মগত ত্রুটি।হেটেরোজাইগাস SPECC1L মিউটেশনগুলি অ্যাটিপিকাল এবং সিন্ড্রোমিক ক্লেফ্ট রোগীদের মধ্যে পাওয়া গেছে।এখানে, আমরা সংস্কৃতিযুক্ত SPECC1L নকডাউন কোষগুলিতে ক্যানোনিকাল আঠালো জংশন (AJ) উপাদানগুলির বর্ধিত দাগ, β-ক্যাটেনিন এবং ই-ক্যাডারিন রিপোর্ট করি এবং ইলেক্ট্রন মাইক্রোগ্রাফগুলি AJ-এর অ্যাপিক্যাল-বেসাল প্রসারণ দেখায়।ক্র্যানিওফেসিয়াল মরফোজেনেসিসে SPECC1L এর ভূমিকা বোঝার জন্য, আমরা একটি Specc1l ঘাটতি মাউস মডেল তৈরি করেছি।হোমোজাইগাস মিউট্যান্ট ভ্রূণের প্রাণঘাতী এবং প্রতিবন্ধী নিউরাল টিউব বন্ধ এবং সিএনসিসি ল্যামিনেশন প্রদর্শন করে।মিউট্যান্ট নিউরাল ভাঁজে এজে প্রোটিন স্টেনিং বৃদ্ধি পায়।এই AJ ত্রুটিটি CNCC ডিলামিনেশনের ত্রুটির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যার জন্য AJ দ্রবীভূত করা প্রয়োজন।উপরন্তু, Specc11 মিউট্যান্টরা PI3K-AKT সংকেত কমিয়েছে এবং অ্যাপোপটোসিস বাড়িয়েছে।ভিট্রোতে, বন্য-ধরনের কোষগুলিতে PI3K-AKT সংকেতের হালকা বাধা AJ পরিবর্তনগুলি প্ররোচিত করার জন্য যথেষ্ট ছিল।গুরুত্বপূর্ণভাবে, SPECC1L নকডাউন দ্বারা প্ররোচিত AJ পরিবর্তনগুলি PI3K-AKT পাথওয়ে সক্রিয় করার মাধ্যমে বিপরীত করা যেতে পারে।একত্রে নেওয়া, এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে PI3K-AKT সংকেত এবং AJ জীববিজ্ঞানের একটি অভিনব নিয়ন্ত্রক হিসাবে SPECC1L, নিউরাল টিউব বন্ধ এবং CNCC স্তরবিন্যাসের জন্য প্রয়োজনীয়।
ক্র্যানিয়াল নিউরাল ক্রেস্ট সেল (CNCCs) ডোরসাল নিউরোইক্টোডার্মে স্থানীয়করণ করে এবং এপিথেলিয়াল-মেসেনকাইমাল ট্রানজিশন (EMT) 1,2,3 এর সাথে জড়িত একটি প্রক্রিয়ার মাধ্যমে বিকাশমান নিউরাল ভাঁজের নিউরোপিথেলিয়াম থেকে বিচ্ছিন্ন হয়।প্রিমিগ্রেটিং এপিথেলিয়াল সিএনসিসিগুলি আন্তঃকোষীয় সংযোগগুলিকে ব্যাহত করে এবং স্থানান্তরিত মেসেনকাইমাল সিএনসিসিতে পরিণত হয় যা প্রথম এবং দ্বিতীয় ফ্যারিঞ্জিয়াল আর্চগুলি পূরণ করে এবং বেশিরভাগ ক্র্যানিওফেসিয়াল কার্টিলেজ গঠন করে।এইভাবে, CNCC ফাংশন নিয়ন্ত্রণ করে এমন জিনগুলি প্রায়ই ক্র্যানিওফেসিয়াল জন্মগত অসঙ্গতি যেমন অরোফেসিয়াল ক্লেফ্টগুলির ইটিওলজিতে ব্যাহত হয়, যা সাধারণত শুধুমাত্র মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রে 1/800 জন জন্মকে প্রভাবিত করে।জন্মগত বিকৃতির মধ্যে একটি ৮.
CNCC এর ডিলামিনেশন ইঁদুরের ভ্রূণ বিকাশের 8.5 থেকে 9.5 দিনের মধ্যে অগ্রবর্তী নিউরাল টিউব বন্ধ হওয়ার সাথে মিলে যায়।বেশ কিছু মাউস অরোফেসিয়াল ক্লেফ্ট-সম্পর্কিত জিনের মিউট্যান্টগুলিও Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 এবং Pdgfrα12 সহ কিছু ধরণের নিউরাল টিউব ত্রুটি প্রদর্শন করে।যাইহোক, নিউরাল টিউব ক্লোজার এবং CNCC স্তরবিন্যাস প্রক্রিয়াগুলিকে স্বতন্ত্র হিসাবে বিবেচনা করা যেতে পারে, কারণ Splotch মিউট্যান্ট মাউস (Pax3) CNCC স্তরীকরণ বা স্থানান্তর 13,14-এর উপর কোনও প্রভাব ছাড়াই নিউরাল টিউব বন্ধে ত্রুটিগুলি প্রদর্শন করে।CNCC ব্যবচ্ছেদ এবং নিউরাল টিউব বন্ধের ত্রুটি সহ অতিরিক্ত মাউস মডেলগুলি এই দুটি প্রক্রিয়ার সাধারণ আণবিক ভিত্তিকে চিত্রিত করতে সহায়তা করবে।
নিউরোএপিথেলিয়াল কোষ থেকে CNCC বিচ্ছিন্ন করার জন্য আঠালো জংশন (AJs) দ্রবীভূত করা প্রয়োজন, যা প্রোটিন কমপ্লেক্সের সমন্বয়ে গঠিত, অন্যান্যগুলির মধ্যে, ই-ক্যাডেরিন, β-ক্যাটেনিন, α-ই-কেটিনিন এবং α-অ্যাক্টিনিন অ্যাক্টিন ফিলামেন্ট 2 এর সাথে যুক্ত। ওভার এক্সপ্রেশন স্টাডিজ ই-ক্যাডেরিন স্নায়ু ভাঁজগুলিতে সিএনসিসি ডিলামিনেশন হ্রাস বা বিলম্ব দেখিয়েছে।বিপরীতভাবে, E-cadherin দমনের ফলে প্রাথমিক স্তরবিন্যাস হয় 15,16।CNCC স্তরবিন্যাসের সময় EMT-এর মধ্যস্থতাকারী অনেকগুলি কারণ হল ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) এবং এক্সট্রা সেলুলার ম্যাট্রিক্স (ECM) রিমডেলিং প্রোটিন যেমন ম্যাট্রিক্স মেটালোপ্রোটিনেসেস (MMPs), তবে CNCC গুলি সরাসরি সাইটোস্কেলেটার। এখনও জানা যায়নিPI3K-AKT পাথওয়ে ই-ক্যাডেরিন স্তরের প্রতিপক্ষ হিসেবে পরিচিত, প্রধানত ক্যান্সার গবেষণা17 থেকে।সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে ইঁদুরের মধ্যে PDGFα-ভিত্তিক PI3K-AKT সংকেত হারানোর ফলে ক্র্যানিওফেসিয়াল অস্বাভাবিকতা দেখা দেয়, যার মধ্যে ক্লেফ্ট প্যালেট এবং নিউরাল টিউব ত্রুটি রয়েছে।যাইহোক, PI3K-AKT পাথওয়ে এবং CNCC স্তরবিন্যাসের উপর AJ স্থিতিশীলতার মধ্যে সম্পর্ক অস্পষ্ট।
আমরা পূর্বে SPECC1L কে দুটি মানুষের মধ্যে প্রথম মিউট্যান্ট জিন হিসাবে চিহ্নিত করেছি যা মুখ থেকে চোখের পর্যন্ত প্রসারিত হয়, যা তির্যক ক্লেফ্ট (ObFC) বা Tessier IV18 cleft নামে পরিচিত।SPECC1L মিউটেশনগুলি অটোসোমাল প্রভাবশালী Opitz G/BBB সিন্ড্রোম (OMIM #145410) সহ দুটি বহু প্রজন্মের পরিবারে চিহ্নিত করা হয়েছে, যেখানে প্রভাবিত ব্যক্তিরা হাইপারডিসটেন্স এবং ক্লেফ্ট ঠোঁট/তালু দেখায়, এবং একটি পরিবারে টিবি ওভারডিস্ট্যান্স সিনড্রোম (OMIM #14545) .Opitz G/BBB সিন্ড্রোমের অর্ধেকেরও বেশি ক্ষেত্রে এক্স-লিঙ্কড (OMIM #300000) এবং MID1 জিনের মিউটেশনের কারণে ঘটে, যা মাইক্রোটিউবুল-সম্পর্কিত কোষ কঙ্কালের প্রোটিন 22কে এনকোড করে।আমরা অনুমান করি যে SPECC1L, এছাড়াও মাইক্রোটিউবুলস এবং অ্যাক্টিন সাইটোস্কেলটনের সাথে যুক্ত একটি প্রোটিন, কোষের আনুগত্য এবং স্থানান্তর 18 এর সময় অ্যাক্টিন সাইটোস্কেলটন পুনর্নির্মাণের জন্য প্রয়োজনীয় সিগন্যালিং মধ্যস্থতা করতে পারে।ইন ভিট্রো এবং ভিভো স্টাডিজের মাধ্যমে, আমরা এখন PI3K-AKT সিগন্যালিংয়ের মাধ্যমে AJ স্থিতিশীলতার একটি অভিনব নিয়ন্ত্রক হিসাবে SPECC1L বর্ণনা করি।সেলুলার স্তরে, SPECC1L ঘাটতির ফলে প্যান-AKT প্রোটিনের স্তর হ্রাস পায় এবং AJ-এর অ্যাপিক্যাল-বেসাল বিচ্ছুরণ বৃদ্ধি পায়, যা AKT পথের রাসায়নিক সক্রিয়করণ দ্বারা নির্মূল হয়েছিল।ভিভোতে, Specc11-ঘাটতি ভ্রূণগুলি প্রতিবন্ধী নিউরাল টিউব বন্ধ এবং CNCC ব্যবচ্ছেদ হ্রাস দেখায়।এইভাবে, মুখের মরফোজেনেসিসের সময় স্বাভাবিক CNCC ফাংশনের জন্য প্রয়োজনীয় অত্যন্ত নিয়ন্ত্রিত কোষ আনুগত্য-ভিত্তিক সংকেতগুলিতে SPECC1L ফাংশন।
সেলুলার স্তরে SPECC1L এর ভূমিকা চিহ্নিত করতে, আমরা SPECC1L18-এ পূর্বে বর্ণিত স্থিতিশীল অস্টিওসারকোমা সেল লাইন U2OS ঘাটতি ব্যবহার করেছি।SPECC1L (kd) নকডাউন সহ এই স্থিতিশীল U2OS কোষগুলিতে SPECC1L ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিনের মাত্রা একটি মাঝারি (60-70%) হ্রাস পেয়েছে, সাথে অ্যাক্টিন সাইটোস্কেলটন 18 এর স্থানান্তর এবং পুনর্গঠনে ত্রুটি রয়েছে। বিপরীতে, একটি গুরুতর ক্ষণস্থায়ী হ্রাস SPECC1L মাইটোটিক ত্রুটির দিকে পরিচালিত করতে দেখা গেছে 23।আরও চরিত্রায়নের পরে, আমরা দেখতে পেলাম যে আমাদের স্থিতিশীল SPECC1L-kd কোষগুলি খুব উচ্চ মাত্রার সঙ্গমে রূপবিদ্যা পরিবর্তন করেছে (চিত্র 1)।স্বতন্ত্র কন্ট্রোল সেল এবং কম সঙ্গমে kd কোষগুলি একই রকম দেখায় (চিত্র 1A, D)।ফিউশনের 24 ঘন্টা পরে, নিয়ন্ত্রণ কোষগুলি তাদের কিউবয়েডাল আকৃতি ধরে রাখে (চিত্র 1B, E), যখন SPECC1L-kd কোষগুলি দীর্ঘায়িত হয় (চিত্র 1C, F)।কন্ট্রোল সেল এবং কেডি কোষের ভিভো লাইভ ইমেজিং (মুভি 1) দ্বারা কোষের আকারে এই পরিবর্তনের পরিমাণ ধরা হয়েছিল।সঙ্গম কোষে SPECC1L এর ভূমিকা নির্ধারণ করতে, আমরা প্রথমে এর অভিব্যক্তি পরীক্ষা করেছি।আমরা দেখতে পেয়েছি যে SPECC1L প্রোটিনের মাত্রা ফিউশনের (চিত্র 1G) উপর বৃদ্ধি পেয়েছে, যেখানে SPECC1L ট্রান্সক্রিপ্টের মাত্রা বৃদ্ধি পায়নি (চিত্র 1H)।উপরন্তু, কোষের ঘনত্ব বৃদ্ধির সাথে সাথে, SPECC1L প্রোটিন আন্তঃকোষীয় সীমানায় জমা হয় (চিত্র 2A-E), একটি প্যাটার্ন ওভারল্যাপিং এর সাথে মেমব্রেন-সম্পর্কিত β-catenin (চিত্র 2A'-E')।অ্যাক্টিন সাইটোস্কেলটন 18,23-এর সাথে SPECC1L-এর অ্যাসোসিয়েশনের প্রেক্ষিতে আমরা অনুমান করেছি যে SPECC1L অ্যাক্টিন-ভিত্তিক আঠালো জংশনের (AJ) সাথে যোগাযোগ করে।
(AF) SPECC1L নকডাউন (DF) কোষগুলি নিয়ন্ত্রণ U2OS কোষের (AC) তুলনায় উচ্চ সঙ্গমে (F) দীর্ঘায়িত হয়।এখানে দেখানো হয়েছে ছয়টি টাইম পয়েন্টের তিনটি (T1, T3, T6) যা আমরা বিভিন্ন কোষের ঘনত্বের জন্য নির্বাচন করেছি।(জি) ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ দেখায় যে SPECC1L প্রোটিন নিয়ন্ত্রণ কোষে কম সঙ্গমের তুলনায় উচ্চ ডিগ্রী সঙ্গমে স্থিতিশীল হয়।SPECC1L-এর ওয়েস্টার্ন ব্লট প্রত্যাশিত 120 kDa ব্যান্ড এবং একটি উচ্চতর আণবিক ওজন ব্যান্ড দেখায়, সম্ভবত অনুবাদ-পরবর্তী পরিবর্তিত (*)।নিম্ন এবং উচ্চ সঙ্গমের জন্য একই অবস্থার অধীনে ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।নিম্ন এবং উচ্চ সঙ্গমে SPECC1L দেখানো চিত্রগুলি একই দাগ থেকে নেওয়া হয়েছিল।একই দাগ সরানো হয়েছিল এবং β-অ্যাক্টিন অ্যান্টিবডি দিয়ে পুনরায় পরীক্ষা করা হয়েছিল।(এইচ) পরিমাণগত RT-PCR বিশ্লেষণে SPECC1L ট্রান্সক্রিপ্ট স্তরে কোন উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন দেখা যায়নি।ত্রুটি বারগুলি চারটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে SEM গুলি উপস্থাপন করে।
(AE) আমরা SPECC1L নকডাউন (kd) সহ কোষের আকার বিশ্লেষণ এবং U2OS কোষে AJ পরিবর্তনগুলি স্বাভাবিক করার জন্য কোষের ঘনত্বের একটি পরিসরের প্রতিনিধিত্বকারী ছয়টি সময় পয়েন্ট (T1-T6) বেছে নিয়েছি।এই সময়ের প্রথম পাঁচটিতে একক কোষ (T1), ছোট কোষের ক্লাস্টারের 50-70% ফিউশন (T2), কেডি কোষ (T3) পুনর্নির্মাণ ছাড়াই ফিউশন, kd কোষের পুনর্নির্মাণ (T4) এবং 24 ঘন্টা পরিবর্তন অন্তর্ভুক্ত ছিল।kd (T5) কোষের পশ্চাৎ অংশে।SPECC1L প্রোটিন প্রধানত T1 (A) তে সাইটোপ্লাজমে বিচ্ছুরিত হয়েছিল, কিন্তু পরবর্তী সময় বিন্দুতে (B-E, তীর) আন্তঃকোষীয় সীমানায় এর জমে পরিলক্ষিত হয়েছিল।(FJ) β-ক্যাটেনিন AJ কমপ্লেক্সের সাথে যুক্ত আন্তঃকোষীয় সীমানায় অনুরূপ জমা দেখায়।(A'-E') SPECC1L এবং β-catenin উচ্চ কোষের ঘনত্বে (তীর) কোষের সীমানায় ওভারল্যাপিং দাগ দেখায়।(F'-J') SPECC1L-kd কোষে, কম কোষের ঘনত্বে (F'-H') β-ক্যাটেনিন দাগ স্বাভাবিক বলে মনে হয়, কিন্তু কোষের আকৃতি পরিবর্তনের সাথে সাথে প্রসারিত হয় (I', J'; তীর), যা নির্দেশ করে যে AJ পরিবর্তিত হয়েছে.বার = 10 µm।
আমরা তখন AJ এর উপর SPECC1L অভাবের প্রভাব নির্ধারণ করার চেষ্টা করেছি।আমরা ক্যানোনিকাল উপাদান F-actin, myosin IIb, β-catenin, এবং E-cadherin24,25,26,27 সহ বেশ কয়েকটি AJ-সংশ্লিষ্ট মার্কার ব্যবহার করেছি।পূর্বে বর্ণিত হিসাবে SPECC1L-kd কোষে অ্যাক্টিন স্ট্রেস ফাইবার বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 3A,B) 18।অ্যাক্টিন ফিলামেন্টের সাথে যুক্ত মায়োসিন IIb ভিট্রোতে SPECC1L-kd কোষে অনুরূপ বৃদ্ধি দেখিয়েছে (চিত্র 3C,D)।AJ-সম্পর্কিত β-catenin কোষের ঝিল্লিতে ক্যাডেরিনের সাথে আবদ্ধ হয়, যা নিয়ন্ত্রণ কিউবোসাইটগুলিতে একটি সাধারণ "মধুচক্র" এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন দেখায় (চিত্র 3E,G)।মজার বিষয় হল, কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে ফ্ল্যাট চিত্রগুলিতে, বিটা-ক্যাটেনিন (চিত্র 3E,F) এবং ই-ক্যাডেরিন (চিত্র 3G,H) সঙ্গমযুক্ত SPECC1L- ঘাটতি কোষগুলির কোষের ঝিল্লিতে দাগ বর্ধিত দাগের বিশিষ্ট নিদর্শনগুলি দেখায়৷কেডি কোষে এজে-সম্পর্কিত β-ক্যাটেনিন স্টেনিংয়ের এই প্রসারণটি সঙ্গমের সময় সবচেয়ে বেশি উচ্চারিত হয়েছিল, কিন্তু কোষের আকারে পরিবর্তনের আগে দেখা গিয়েছিল (চিত্র 2F-J, F'-J')।এই বর্ধিত AJ স্টেনিংয়ের শারীরিক প্রকৃতি নির্ধারণ করতে, আমরা ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) (চিত্র 3I,J) দ্বারা SPECC1L-kd U2OS কোষের অ্যাপিক্যাল-বেসাল পৃষ্ঠের কোষের সীমানা পরীক্ষা করেছি।কন্ট্রোল সেলের বিপরীতে (চিত্র 3I), যেখানে AJ (তীর) নির্দেশক পৃথক ইলেকট্রন ঘন অঞ্চল ছিল, kd কোষ (চিত্র 3J) অ্যাপিকোবাসাল সমতল বরাবর AJ-এর উচ্চ ইলেক্ট্রন ঘনত্ব নির্দেশক বড়, সংলগ্ন অঞ্চলগুলি দেখিয়েছে।.উপরন্তু, ট্রান্সভার্স বিভাগে, আমরা কেডি কোষে (চিত্র S1A,B) বিস্তৃত কোষের ঝিল্লির ভাঁজ পর্যবেক্ষণ করেছি, যা বিটা-ক্যাটেনিন এবং ই-ক্যাডেরিন স্টেনিং ব্যান্ডের (চিত্র 3F, H) বর্ধিত প্যাটার্ন ব্যাখ্যা করে।AJs-এ SPECC1L-এর ভূমিকার সমর্থনে, β-catenin SPECC1L-এর সাথে মিলিত U2OS কোষের (চিত্র 3K) লাইসেটে সহ-ইমিউনোপ্রিসিপিটেড হয়েছিল।AJ মার্কারগুলির জন্য বর্ধিত ইমিউনোস্টেইনিংয়ের পাশাপাশি, TEM বিশ্লেষণ আমাদের অনুমানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল যে SPECC1L ঘাটতি AJ অ্যাপিক্যাল-বেসাল ঘনত্ব এবং বৈচিত্র্যকে বাড়িয়ে তোলে।
(এএইচ) 48 ঘন্টা পোস্ট-ফিউশনে (T6; A, B) কেডি কোষে এফ-অ্যাক্টিন স্টেনিং বৃদ্ধি পেয়েছে।F-actin (C, D) এর সাথে যুক্ত মায়োসিন IIb এর পরিবর্তিত দাগ।কন্ট্রোল সেল (ই, জি) তে β-ক্যাটেনিন এবং ই-ক্যাডারিন ঝিল্লি স্টেনিংয়ের মসৃণ প্যাটার্নটি SPECC1L-kd (F, H) কোষগুলিতে উন্নত করা হয়েছিল।বার = 10 µm।(I-J) ইলেক্ট্রন মাইক্রোগ্রাফগুলি অ্যাপিক্যাল-বেসাল আন্তঃকোষীয় জংশন পর্যবেক্ষণ করছে।কন্ট্রোল সেলগুলি স্বতন্ত্র ইলেকট্রন-ঘন অঞ্চলগুলি দেখায় যা স্টিকি জংশনগুলি নির্দেশ করে (I, তীর)।বিপরীতে, SPECC1L-kd কোষে সমগ্র এপিকাল-বেসাল জংশনটি ইলেক্ট্রন ঘন (J, তীর) দেখায়, যা আঠালো জংশনের বর্ধিত ঘনত্ব এবং বিচ্ছুরণ নির্দেশ করে।(কে) বিটা-ক্যাটেনিনকে SPECC1L-এর সাথে মিলিত U2OS সেল লাইসেটে সহ-ইমিউনোপ্রিসিপিটেড করা হয়েছিল।চারটি স্বাধীন পরীক্ষার একটি প্রতিনিধিত্ব করে একটি স্থান থেকে নেওয়া চিত্র।
ক্র্যানিওফেসিয়াল মরফোজেনেসিসে SPECC1L এর ভূমিকা বোঝার জন্য, আমরা দুটি স্বতন্ত্র ES ট্র্যাপ সেল লাইন, DTM096 এবং RRH048 (BayGenomics, CA) ব্যবহার করে একটি Specc1l ঘাটতি মাউস মডেল তৈরি করেছি, যা intron 1 এবং Specc1l ট্রান্সক্রিপ্টগুলি F15 এ ক্যাপচার করা হয়েছিল। .4A, চিত্র S2)।ডিকয় ভেক্টর সন্নিবেশের জিনোমিক অবস্থান সম্পূর্ণ জিনোম সিকোয়েন্সিং দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল এবং PCR (চিত্র S2) দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল।উভয় জিন ট্র্যাপ ডিজাইনই ক্যাপচারের পরে Specc11-lacZ রিপোর্টারদের ইন-ফ্রেম ফিউশনের অনুমতি দেয়।অতএব, X-gal স্টেনিং দ্বারা নির্ধারিত lacZ এক্সপ্রেশনটি Specc11 এক্সপ্রেশনের সূচক হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।উভয় অ্যালিলই একই রকম ল্যাকজেড এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন দেখায়, ইনট্রন 1-এ DTM096 জিন ট্র্যাপ ইন্ট্রন 15-এ RRH048-এর চেয়ে শক্তিশালী অভিব্যক্তি দেখায় (দেখানো হয়নি)।যাইহোক, Specc1l ব্যাপকভাবে প্রকাশ করা হয়, বিশেষ করে E8.5 (চিত্র 4B), নিউরাল টিউব এবং E9.5 এবং E10.5 (চিত্র 4C,D) তে মুখের প্রসেসে এবং অঙ্গ-প্রত্যঙ্গের বিকাশে নিউরাল ভাঁজগুলিতে বিশেষভাবে শক্তিশালী অভিব্যক্তি সহ। E10 এ।5 এবং চোখ (চিত্র 4D)।আমরা পূর্বে রিপোর্ট করেছি যে E10.5 এ প্রথম ফ্যারিঞ্জিয়াল খিলানে SPECC1L এক্সপ্রেশনটি এপিথেলিয়াম এবং অন্তর্নিহিত মেসেনকাইম 18-এ উপস্থিত ছিল, সিএনসিসি বংশের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।CNCC-এ SPECC1L এক্সপ্রেশন পরীক্ষা করার জন্য, আমরা E8.5 নিউরাল ফোল্ডস (চিত্র 4E-J) এবং E9.5 স্কাল সেকশন (চিত্র 4K-) সম্পাদন করেছি।E8.5 এ, SPECC1L দাগযুক্ত নিউরাল ভাঁজগুলি তীব্রভাবে (চিত্র 4E, H), এনসিসি মার্কার দিয়ে দাগযুক্ত কোষ সহ (চিত্র 4G, J)।E9.5 এ, SPECC1L (Fig. 4K, N) AP2A (Fig. 4L, M) বা SOX10 (Fig. 4O, P) এর সাথে সহ-দাগযুক্ত মাইগ্রেটিং সিএনসিসিকে শক্তভাবে দাগ দেয়।
(A) মাউস Specc11 জিনের পরিকল্পিত উপস্থাপনা ES DTM096 (intron 1) এবং RRH048 (intron 15) সেল ক্লোনগুলিতে ডিকয় ভেক্টর সন্নিবেশ দেখায়।(BD) হেটেরোজাইগাস Specc1lDTM096 ভ্রূণের lacZ স্টেনিং E8.5 থেকে E10.5 পর্যন্ত Specc1l এক্সপ্রেশনের প্রতিনিধিত্ব করে।NE = neuroectoderm, NF = নিউরাল ফোল্ড, PA1 = প্রথম ফ্যারিঞ্জিয়াল আর্চ।(EP) E8.5 (NF; EJ) নিউরাল ভাঁজ এবং E9.5 (KP) মাথার খুলি বিভাগে NCC মার্কার AP2A এবং SOX10 সহ SPECC1L ইমিউনোস্টেইনিং।AP2A (F, G; অ্যারোহেডস) এবং SOX10 (I, J; অ্যারোহেডস) লেবেলযুক্ত কোষ সহ নিউরাল ভাঁজ E8.5 (E, H; অ্যারোহেডস) এ SPECC1L স্টেনিং ব্যাপকভাবে পরিলক্ষিত হয়েছে।E9.5-এ, SPECC1L AP2A (L, M; তীর) এবং SOX10 (O, P; তীর) লেবেলযুক্ত মাইগ্রেটিং CNCCs (K, N; তীর) দৃঢ়ভাবে দাগ দিয়েছে।
হেটেরোজাইগাস Specc1lDTM096/+ এবং Specc1lRRH048/+ ইঁদুরের মধ্যে ক্রসিং দেখায় যে দুটি জিন ট্র্যাপ অ্যালিল পরিপূরক নয় এবং সেই যৌগ হেটেরোজাইগোটস এবং ভ্রূণীয় হোমোজাইগোট জিন ট্র্যাপ অ্যালিলের জন্য ভ্রূণের প্রাণঘাতী (টেবিল S1)।মেন্ডেলিয়ান অনুপাত জন্মের সময় হেটেরোজাইগোটদের বেঁচে থাকার হার হ্রাসকে নির্দেশ করে (প্রত্যাশিত 1.34 বনাম 2.0)।আমরা heterozygotes মধ্যে কম প্রসবকালীন মৃত্যুর হার লক্ষ করেছি, কারো কারো মধ্যে ক্র্যানিওফেসিয়াল অসঙ্গতি ছিল (চিত্র S3)।যাইহোক, এই পেরিনেটাল ক্র্যানিওফেসিয়াল ফেনোটাইপগুলির কম অনুপ্রবেশ তাদের অন্তর্নিহিত প্যাথোফিজিওলজিকাল প্রক্রিয়াগুলি অধ্যয়ন করা কঠিন করে তোলে।অতএব, আমরা হোমোজাইগাস স্পেক 11 মিউট্যান্টের ভ্রূণের প্রাণঘাতী ফেনোটাইপের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছি।
বেশিরভাগ যৌগ হেটেরোজাইগাস বা হোমোজাইগাস স্পেক1lDTM096/RRH048 মিউট্যান্ট ভ্রূণ E9.5–10.5 (Figs. 5A–D) এর পরে বিকশিত হয়নি, এবং নিউরাল টিউব পূর্ববর্তীভাবে বন্ধ হয়নি (Figs. 5B, D) এবং কখনও কখনও পিছনের দিকে বন্ধ (দেখানো হয়নি) ..এই ক্র্যানিয়াল নিউরাল টিউব ক্লোজার ত্রুটিটি E10.5 এ নিউরাল ভাঁজগুলিতে অবশিষ্ট CNCC চিহ্নিত DLX2 এর সংখ্যাগরিষ্ঠের সাথে যুক্ত ছিল, কোন ব্যবচ্ছেদ নির্দেশ করে না (চিত্র 5A'-D')।CNCC-এর সামগ্রিক আকারও হ্রাস করা হয়েছে কিনা তা নির্ধারণ করতে, আমরা Wnt1-Cre এবং ROSAmTmG এর সাথে আমাদের জিন ট্র্যাপ লাইনগুলিতে GFP এর সাথে CNCC লাইনগুলি ট্যাগ করেছি।আমরা পুরো ভ্রূণ থেকে সাজানো GFP+ NCC এবং GFP- (RFP+) নন-এনসিসি স্ট্রিম করি।E9.5 এ, ফ্লো-সর্টেড GFP-লেবেলযুক্ত CNCC-এর অনুপাত WT এবং মিউট্যান্ট ভ্রূণের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়নি (দেখানো হয়নি), যা সাধারণ CNCC স্পেসিফিকেশন নির্দেশ করে।অতএব, আমরা অনুমান করেছিলাম যে উন্মুক্ত স্নায়ু ভাঁজগুলিতে অবশিষ্ট Wnt1-Cre এবং DLX2 স্টেনিং ত্রুটিপূর্ণ CNCC লেয়ারিংয়ের কারণে হয়েছিল, সম্ভবত SPECC1L-kd কোষে দেখা গেছে AJ কোষগুলির ঘনত্ব বা বিচ্ছুরণের কারণে।আমরা নিউরাল ফোল্ডে CNCC এর উপস্থিতি নিশ্চিত করতে SOX10, AP2A, এবং DLX2 NCC চিহ্নিতকারী ব্যবহার করেছি (চিত্র 5E-R)।E8.5 এ, তিনটি NCC মার্কারের জন্য নিউরাল ফোল্ড স্টেনিং WT (চিত্র 5E, G, I) এবং Specc1l মিউট্যান্ট (চিত্র 5F, H, J) বিভাগে পরিলক্ষিত হয়েছিল।E9.5 এ, যখন NCC চিহ্নিতকারীরা WT বিভাগে স্থানান্তরিত NCC দাগ দেয় (চিত্র 5M, O, Q), অবশিষ্ট NCC দাগ Specc1l মিউট্যান্ট ভ্রূণের উন্মুক্ত স্নায়ু ভাঁজগুলিতে পরিলক্ষিত হয়েছিল (চিত্র 5N, P, R)।যেহেতু SOX10 এবং DLX2 চিহ্নিত CNCCগুলি স্থানান্তরিত করে, এই ফলাফলটি পরামর্শ দেয় যে SPECC1L- ঘাটতি CNCCগুলি পোস্ট-মাইগ্রেটরি স্পেসিফিকেশন অর্জন করে কিন্তু নিউরাল ভাঁজ থেকে স্থানান্তর করতে ব্যর্থ হয়।
Specc11 এর ঘাটতি ত্রুটিপূর্ণ নিউরাল টিউব বন্ধ, ক্র্যানিয়াল নিউরাল ক্রেস্ট কোষ এবং AJs এর বিলুপ্তির দিকে পরিচালিত করে।
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') লেবেলযুক্ত মাইগ্রেটিং ক্র্যানিয়াল নিউরাল ক্রেস্ট সেল (CNCC) বহনকারী ভ্রূণ।বিপরীতে, Specc11 মিউট্যান্ট ভ্রূণগুলি ওপেন নিউরাল ফোল্ডস (B), অ্যারোহেডস) এবং CNCCগুলি দেখায় যেগুলি স্থানান্তরিত হয়নি (B', অ্যারোহেড)।(C, D') E10.5 WT ভ্রূণ (C, C') এবং Specc1l (D, D') এর CNCC মার্কার DLX2 এর উজ্জ্বল ক্ষেত্র চিত্র (C, D') এবং ইমিউনোস্টেইনিং (C', D')।WT E10.5 ভ্রূণে, DLX2-পজিটিভ CNCC ফুলকা খিলান (C', তীর) উপনিবেশিত করে, যখন মিউট্যান্টদের মধ্যে, সুস্পষ্ট দাগ খোলা স্নায়ু ভাঁজ (D', তীর) এবং প্রথম ফ্যারিঞ্জিয়াল আর্চে (D',) টিকে থাকে। তীর)।) কিছু দাগযুক্ত (তীর) যা সিএনসিসির দুর্বল ডিলামিনেশন এবং মাইগ্রেশন নির্দেশ করে।ER) E8.5 (E–L) এবং E9.5 (M–R) পর্যায়ে WT এবং Specc1l মিউট্যান্ট ভ্রূণের বিভাগগুলিকে NCC মার্কার SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,) দিয়ে লেবেল করা হয়েছিল O, P ) এবং DLX2 (I, J, Q, R)।E8.5 এ, এনসিসি স্টেনিং ওয়াইল্ড-টাইপ নিউরাল ফোল্ড (এনএফ) এবং মিউট্যান্ট বিভাগে পরিলক্ষিত হয়েছিল।E8.5 WT (K) এবং মিউট্যান্ট (L) তে SOX10 এবং β-catenin-এর সহ-দাগ স্নায়ু ভাঁজগুলিতে কোষের সীমানায় β-catenin দাগের বৃদ্ধি প্রকাশ করেছে।E9.5 এ, মাইগ্রেটিং CNCCs (M, O, Q) এর বন্য-প্রকার দাগ পরিলক্ষিত হয়েছে, যখন মিউট্যান্টদের মধ্যে, unstratified CNCC গুলি খোলা নিউরাল ভাঁজ (N, P, R) দাগ দেয়।(S–Z) ইন ভিভো এজে লেবেলিং বিশ্লেষণ WT এর করোনাল বিভাগে এবং E9.5 মিউটেশন সহ Specc11DTM096/RRH048 ভ্রূণ।উপরের ডান কোণায় একটি আনুমানিক বিভাগীয় সমতল দেখানো হয়েছে।মিউট্যান্ট টিস্যুগুলির বিভাগে, F-actin (S, T) এবং মায়োসিন IIb (U, V) এর বর্ধিত দাগ লক্ষ্য করা গেছে।চিত্র 3-এর ইন-ভিট্রো ফলাফলের মতো, মিউট্যান্ট ভ্রূণে, β-ক্যাটেনিন (W, X) এবং E-cadherin (Y, Z) এর জন্য বর্ধিত ঝিল্লির দাগ পরিলক্ষিত হয়েছে।(AA-BB) এপিকাল-বেসাল কোষের সীমানা ছাড়িয়ে একটি বন্য-প্রকার ভ্রূণের একটি অংশের একটি ইলেক্ট্রন মাইক্রোগ্রাফ আঠালো জংশনের (AA, তীর) নির্দেশক একটি স্বতন্ত্র ইলেকট্রন-ঘন অঞ্চল দেখায়।বিপরীতে, Specc11 মিউট্যান্ট ভ্রূণ (BB, তীর) এর অংশগুলিতে, সমগ্র এপিকোবাসাল জংশনটি ইলেক্ট্রন ঘন, যা আঠালো জংশনের বর্ধিত ঘনত্ব এবং বিচ্ছুরণ নির্দেশ করে।
পরিবর্তিত AJ-এর কারণে লেয়ারিং কমে গেছে বলে আমাদের অনুমান পরীক্ষা করার জন্য, আমরা Specc1l মিউট্যান্ট ভ্রূণের (চিত্র 5S-Z) উন্মুক্ত স্নায়ু ভাঁজগুলিতে AJ লেবেল পরীক্ষা করেছি।আমরা অ্যাক্টিন স্ট্রেস ফাইবারগুলির বৃদ্ধি (চিত্র 5 এস, টি) এবং অ্যাক্টিন ফাইবারগুলিতে মায়োসিন IIB স্টেনিংয়ের একটি সহগামী বৃদ্ধি লক্ষ্য করেছি (চিত্র 5U, V)।গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা আন্তঃকোষীয় সীমানায় β-ক্যাটেনিন (চিত্র 5W,X) এবং ই-ক্যাডেরিন (চিত্র 5Y,Z) এর বর্ধিত দাগ লক্ষ্য করেছি।আমরা E8.5 ভ্রূণের নিউরাল ভাঁজগুলিতে NCC-এর β-ক্যাটেনিন স্টেনিংও পরীক্ষা করেছি (চিত্র 5K, L)।Specc1l মিউট্যান্ট নিউরাল ফোল্ডে (চিত্র 5L এবং K) β-ক্যাটেনিন স্টেনিং আরও শক্তিশালী বলে মনে হয়েছিল, যা পরামর্শ দেয় যে AJ পরিবর্তন শুরু হয়েছে।E9.5 ভ্রূণের খুলির অংশের ইলেক্ট্রন মাইক্রোগ্রাফে, আমরা আবার WT (চিত্র 5AA, BB এবং S1E-H) এর তুলনায় Specc1l মিউট্যান্ট ভ্রূণগুলিতে ছড়িয়ে থাকা ইলেকট্রন-ঘন দাগ লক্ষ্য করেছি।একত্রে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি SPECC1L-kd U2OS কোষগুলিতে আমাদের ইন ভিট্রো ফলাফলগুলিকে সমর্থন করে এবং পরামর্শ দেয় যে আমাদের মিউট্যান্ট ভ্রূণগুলিতে CNCC স্তরবিন্যাসের আগে বিভ্রান্ত AJ দাগ।
AKT কার্যকলাপ এবং E-cadherin স্থিতিশীলতার মধ্যে পরিচিত বিরোধী সম্পর্কের পরিপ্রেক্ষিতে, 17,28 আমরা PI3K-AKT সিগন্যালিং এর জড়িত থাকার অনুমান করেছি।উপরন্তু, আমরা আমাদের কিছু মিউট্যান্ট ভ্রূণে সাবপিডার্মাল ফোসকা দেখেছি যেগুলি E9.5-10.5 এ প্রাণঘাতী (<5%) এড়িয়ে গেছে এবং পরিবর্তে প্রায় E13.5 (চিত্র S3) এ স্থির হয়েছে।সাবপিডার্মাল ভেসিকলগুলি PDGFRα12 এর উপর ভিত্তি করে PI3K-AKT সংকেত হ্রাসের একটি বৈশিষ্ট্য।ফান্টাউজো এট আল।(2014) রিপোর্ট করেছে যে PdgfraPI3K/PI3K মিউট্যান্ট ভ্রূণগুলিতে PDGFRα-ভিত্তিক PI3K অ্যাক্টিভেশনের ব্যাঘাতের ফলে সাবপিডার্মাল ভেসিকল, নিউরাল টিউব ত্রুটি এবং ক্লেফ্ট প্যালেট ফেনোটাইপ হয়।প্রকৃতপক্ষে, Specc1l মিউট্যান্ট টিস্যুতে ভিভোতে প্যান-AKT এবং সক্রিয় ফসফরিলেটেড Ser473-AKT-এর মাত্রা কমিয়ে E9.5 ভ্রূণ গ্রেফতার করা হয়েছে (চিত্র 6A-D)।phosphorylated Ser473-AKT-এর মাত্রা হ্রাস সম্পূর্ণরূপে ভিভো (FIG. 6E) এবং in vitro (FIG. 6F) তে প্যান-AKT-এর মাত্রা হ্রাসের কারণে হতে পারে।একটি ইন ভিট্রো হ্রাস শুধুমাত্র তখনই পরিলক্ষিত হয়েছিল যখন U2OS কোষগুলি কোষের আকার এবং AJ ঘনত্বের পরিবর্তনের সাথে দৃঢ়ভাবে মিলিত হয়েছিল (চিত্র 6D)।সুতরাং, আমাদের ডেটা পরামর্শ দেয় যে SPECC1L ক্র্যানিওফেসিয়াল মরফোজেনেসিসে PI3K-AKT সংকেতের একটি অভিনব ইতিবাচক নিয়ন্ত্রক।
(A–E) E8.5 (A,B) এবং E9.5 (C,D) খুলির অংশ বা Specc1l মিউট্যান্ট ভ্রূণ (E) থেকে E9.5 লাইসেট সক্রিয় ফসফোরিলেড S473-AKT এবং প্যান-AKT প্রোটিন হ্রাসের মাত্রা দেখাচ্ছে , নিয়ন্ত্রণ WT এর তুলনায়।ওয়েস্টার্ন ব্লটিং একই অবস্থার অধীনে ওয়াইল্ড-টাইপ লাইসেট এবং মিউট্যান্ট লাইসেটগুলিতে সঞ্চালিত হয়েছিল।SPECC1L-এর জন্য দেখানো ছবিগুলি একটি ব্লট থেকে নেওয়া হয়েছে৷একই দাগটি সরানো হয়েছিল এবং অ্যান্টি-প্যান-এসিটি এবং β-অ্যাক্টিন অ্যান্টিবডিগুলির সাথে পুনরায় পরীক্ষা করা হয়েছিল।E8.5 স্নায়ু ভাঁজগুলিতে প্যান-AKT স্তরগুলি (A, B) এবং E9.5 খুলি বিভাগে ফসফরিলেটেড S473-AKT এর স্তরগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে।(F) উচ্চ সঙ্গমে কাটা SPECC1L-kd U2OS কোষগুলির লাইসেটে প্যান-AKT মাত্রা একইভাবে হ্রাস পেয়েছে।ত্রুটি বার তিনটি স্বাধীন ওয়েস্টার্ন ব্লট কোয়ান্টিফিকেশন থেকে এসইএমগুলি উপস্থাপন করে।(GJ) E9.5-এ WT ভ্রূণের অংশগুলি যথাক্রমে KI67 এবং ক্লিভড ক্যাসপেস 3 দিয়ে দাগযুক্ত, কোষের বিস্তার (G, G') এবং সামান্য অ্যাপোপটোটিক কার্যকলাপ (H, H') দেখায়।Specc11 মিউট্যান্ট ভ্রূণ তুলনীয় কোষের বিস্তার (I) দেখায়, কিন্তু অ্যাপোপটোসিস হওয়া কোষের সংখ্যা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (J)।
তারপরে আমরা প্রসারণ এবং অ্যাপোপটোসিসের চিহ্নিতকারীগুলি পরীক্ষা করেছি।আমরা WT মিউট্যান্টের জন্য 82.5% এবং KI67 স্টেনিং (p <0.56, Fisher's) দ্বারা পরিমাপকৃত Specc1l মিউট্যান্টগুলির জন্য 82.5% প্রসারণ সূচকের সাথে E9.5 ভ্রূণের বিস্তারে (I এর তুলনায় চিত্র 6E, G) কোনও পার্থক্য লক্ষ্য করিনি। সঠিক পরীক্ষা)।একইভাবে, আমরা E8.5 এ নিউরাল ভাঁজগুলিতে ক্লিভড ক্যাসপেস 3 এর জন্য দাগ দিয়ে পরিমাপ করা অ্যাপোপটোসিসে কোনও পার্থক্য লক্ষ্য করিনি যতক্ষণ না ভ্রূণ গ্রেপ্তার (দেখানো হয়নি) (দেখানো হয়নি)।বিপরীতে, সমস্ত E9.5 মিউট্যান্ট ভ্রূণে (চিত্র 6F, H এবং J) অ্যাপোপটোসিস উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে।অ্যাপোপটোসিসের এই সামগ্রিক বৃদ্ধি হ্রাস PI3K-AKT সংকেত এবং প্রাথমিক ভ্রূণের প্রাণঘাতী 29,30,31 এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।
এরপরে, আমাদের kd কোষে AJ পরিবর্তনে PI3K-AKT সংকেতের জন্য একটি কার্যকারণ ভূমিকা নিশ্চিত করতে, আমরা রাসায়নিকভাবে নিয়ন্ত্রণ এবং kd কোষের পথ পরিবর্তন করেছি (চিত্র 7A-F)।আমরা সঙ্গম SPECC1L-kd কোষে পরিলক্ষিত কোষের আকৃতি পরিবর্তনের ফেনোটাইপ চিহ্নিতকারী হিসাবে ব্যবহার করেছি, যা আমরা সংশ্লিষ্ট উল্লম্ব মাত্রা (প্রস্থ) থেকে দীর্ঘতম মাত্রা (দৈর্ঘ্য) এর অনুপাত ব্যবহার করে পরিমাপ করেছি।অপেক্ষাকৃত বৃত্তাকার বা কিউবয়েডাল কোষের জন্য 1 অনুপাত প্রত্যাশিত (চিত্র 7G)।কোষের আকৃতি ছাড়াও, আমরা β-ক্যাটেনিন স্টেনিং (চিত্র 7A'-F') দ্বারা AJ-এর উপর প্রভাব নিশ্চিত করেছি।ওয়ার্টম্যানিন ব্যবহার করে PI3K-AKT পথের বাধা নিয়ন্ত্রণ কোষে কোষের আকার পরিবর্তন করতে যথেষ্ট ছিল (চিত্র 7A, C) এবং AJ (চিত্র 7A')।PI3K-AKT অ্যাক্টিভেটর SC-79 নিয়ন্ত্রণ কোষে কোষের আকার (FIG. 7A, E) বা AJ সম্প্রসারণ (FIG. 7A') প্রভাবিত করেনি।SPECC1L-kd কোষে, PI3K-AKT পথের আরও দমনের ফলে অ্যাপোপটোসিস বৃদ্ধি পায় (চিত্র 7B,D) এবং β-ক্যাটেনিন স্টেনিং (চিত্র 7B'), আমাদের ভিভো হেভি মিউট্যান্টগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।গুরুত্বপূর্ণভাবে, PI3K-AKT পাথওয়ের সক্রিয়করণ কোষের আকারে উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নতি করেছে (চিত্র 7B,F) এবং AJ ফেনোটাইপস (চিত্র 7B")।কোষের আকারের পরিবর্তনগুলি কোষের গোলাকার অনুপাত (CCR) হিসাবে পরিমাপ করা হয়েছিল এবং উপরে বর্ণিত তাত্পর্যের জন্য তুলনা করা হয়েছিল (FIG. 7G)।প্রকৃতপক্ষে, নিয়ন্ত্রণ কোষে (চিত্র 7জি, সিসিআর = 1.56), ওয়ার্টম্যানিন চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে কোষের আকৃতি পরিবর্তন করতে যথেষ্ট ছিল (চিত্র 7জি, সিসিআর = 3.61, পি <2.4 × 10-9) পরিলক্ষিত একটির মতো। SPECC1L-এ।-kd কোষ (চিত্র 7G, CCR = 3.46)।SPECC1L-kd কোষের Wortmannin চিকিত্সা (চিত্র 7G, CCR = 3.60, নগণ্য) চিকিত্সা না করা kd কোষ (চিত্র 7G, CCR = 3.46, নগণ্য) বা wortmannin-চিকিত্সা নিয়ন্ত্রণ কোষ (চিত্র 7G) এর চেয়ে বেশি উল্লেখযোগ্য ছিল না।, CCR = 3.46, নগণ্য) অতিরিক্তভাবে কোষের প্রসারণকে প্রভাবিত করে (7G, CCR = 3.61, নগণ্য)।সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণভাবে, SC-79 AKT অ্যাক্টিভেটর SPECC1L-kd কোষগুলির দীর্ঘায়িত ফেনোটাইপ পুনরুদ্ধার করেছে (চিত্র 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12)।এই ফলাফলগুলি নিশ্চিত করে যে SPECC1L PI3K-AKT সংকেত নিয়ন্ত্রণ করে এবং পরামর্শ দেয় যে SPECC1L-এর মাঝারি হ্রাস কোষের আনুগত্যকে প্রভাবিত করে, যখন একটি শক্তিশালী হ্রাস apoptosis (চিত্র 8) বাড়ে।
(A–F') নিয়ন্ত্রণ (A, C, E) এবং SPECC1L-kd (B, D, F) কোষগুলি PI3K-AKT পাথওয়ে ইনহিবিটর ওয়ার্টম্যানিন (C, D) বা SC-79 অ্যাক্টিভেটর (E, F) চিকিত্সার মাধ্যমে চিকিত্সা করা হয় চিকিত্সা না করা কন্ট্রোল কোষগুলি কিউবয়েডাল (A) স্বাভাবিক β-বিড়াল সেলুলার স্টেনিং (A'), যখন kd কোষগুলি বর্ধিত β-বিড়াল স্টেনিং (B') সহ দীর্ঘায়িত (B) হয়।PI3K-AKT পাথওয়েকে দমন করার পরে, নিয়ন্ত্রণ কোষগুলি β-cat সম্প্রসারণ (C') সহ দীর্ঘায়িত (C) হয়, যখন kd কোষগুলি অ্যাপোপটোসিস (D) হতে শুরু করে, আমাদের অত্যন্ত পরিবর্তিত ভ্রূণের মতো এবং অত্যন্ত বর্ধিত β-বিড়াল দেখায়।দাগ দেওয়া (D')।PI3K-AKT পাথওয়ে সক্রিয় করার পরে, নিয়ন্ত্রণ কোষগুলি কিউবয়েডাল (E) থেকে যায় এবং স্বাভাবিক β-cat (E') দাগ ছিল, যখন kd কোষগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত কোষের আকার (F) এবং β-cat (F') দাগ দেখায়, যা নির্দেশ করে (G) মেটামর্ফ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে দীর্ঘতম মাত্রা (দৈর্ঘ্য) এবং সংশ্লিষ্ট উল্লম্ব মাত্রা (প্রস্থ) এর সেল রাউন্ডনেস অনুপাত (সিসিআর) ব্যবহার করে (এএফ) কোষের আকার পরিবর্তনের মাত্রা পরিমাপ করা হয়েছিল।চিকিত্সা না করা (NT) SPECC1L-kd কোষগুলি (CCR = 3.46) নিয়ন্ত্রণ কোষগুলির তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে দীর্ঘ ছিল (CCR = 1.56, p <6.1 × 10–13)।নিয়ন্ত্রণ কোষে PI3K-AKT পাথওয়ের ওয়ার্টের বাধা কোষের আকারে অনুরূপ প্রসারিত হওয়ার জন্য যথেষ্ট ছিল (CCR=3.61, p<2.4×10-9)।একইভাবে, SPECC1L-kd কোষে SC-79 দ্বারা AKT সক্রিয়করণ কোষের প্রসারণকে নিয়ন্ত্রণের স্তরে পুনরুদ্ধার করেছে (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12)।SPECC1L-kd কোষের Wortmannin চিকিত্সার ফলে অ্যাপোপটোসিস বৃদ্ধি পেয়েছে কিন্তু অপরিশোধিত kd (CCR=3.46, ns) বা wortmannin-চিকিত্সা করা নিয়ন্ত্রণ কোষ (3.61) এর তুলনায় কোষের আকৃতির পরিবর্তন (CCR=3.60) আর কোনো বৃদ্ধি পায়নি।ns = কোন ব্যাপার না।+/- 50 টি কোষের জন্য SEM পরিমাপ দেখানো হয়েছে।শিক্ষার্থীর টি-টেস্ট ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত পার্থক্য গণনা করা হয়েছিল।
(A) PI3K-AKT পথের বাধা এবং সক্রিয়করণের পরিকল্পিত উপস্থাপনা যার ফলে যথাক্রমে AJ পরিবর্তন এবং উদ্ধার হয়।(বি) SPECC1L দ্বারা AKT প্রোটিন স্থিতিশীলতার জন্য প্রস্তাবিত মডেল।
পূর্ববর্তী নিউরাল ফোল্ড নিউরোএপিথেলিয়াল কোষ 1,15,32 থেকে আলাদা করার জন্য প্রিমিগ্রেটরি CNCCগুলির জন্য AJ lysis প্রয়োজন।AJ উপাদানগুলির বর্ধিত দাগ এবং ভিট্রো এবং ভিভো উভয় ক্ষেত্রেই SPECC1L- ঘাটতি কোষে apical-basal AJ অসমমিতিক বিতরণের ক্ষতি, SPECC1L-এর সাথে β-catenin এর শারীরিক নৈকট্যের সাথে মিলিত, পরামর্শ দেয় যে SPECC1L ফাংশনগুলি AJ স্থানীয় স্থিতিশীলতার জন্য সঠিকভাবে বজায় রাখতে পারে। সংগঠন পেশী।অ্যাক্টিন সাইটোস্কেলটন।অ্যাক্টিন সাইটোস্কেলটন এবং β-ক্যাটেনিন এর সাথে SPECC1L এর সংযোগ এবং SPECC1L এর অনুপস্থিতিতে ঘনীভূত অ্যাক্টিন ফিলামেন্টের সংখ্যা বৃদ্ধি AJ ঘনত্বের পরিলক্ষিত বৃদ্ধির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।আরেকটি সম্ভাবনা হল যে SPECC1L-এর ঘাটতি কোষে অ্যাক্টিন ফাইবারের বর্ধিত সংখ্যা আন্তঃকোষীয় উত্তেজনার পরিবর্তন ঘটায়।যেহেতু সেলুলার স্ট্রেস AJ 33 গতিবিদ্যাকে প্রভাবিত করে, তাই ভোল্টেজের পরিবর্তনের ফলে AJ 34 আরও ছড়িয়ে পড়তে পারে।তাই যেকোনো পরিবর্তন CNCC স্তরগুলিকে প্রভাবিত করবে।
Wnt1 প্রাথমিক নিউরাল ভাঁজে প্রকাশ করা হয় যা নিউরাল ক্রেস্ট কোষের জন্ম দেয়।এইভাবে, Wnt1-cre বংশের ট্রেসিং NCC35-এর আগে এবং মাইগ্রেশন উভয়কেই চিহ্নিত করে।যাইহোক, Wnt1 প্রারম্ভিক নিউরাল ফোল্ড 35,36 থেকে প্রাপ্ত ডোরসাল ব্রেন টিস্যু ক্লোনগুলিকেও চিহ্নিত করে, যার ফলে ওপেন নিউরাল ফোল্ডে Wnt1 মার্কারের জন্য আমাদের E9.5 মিউট্যান্টের দাগ CNCC নয়।NCC চিহ্নিতকারী AP2A এবং SOX10-এর জন্য আমাদের ইতিবাচক দাগ নিশ্চিত করেছে যে Specc11 মিউট্যান্ট ভ্রূণের উন্মুক্ত স্নায়ু ভাঁজগুলিতে প্রকৃতপক্ষে CNCC রয়েছে।উপরন্তু, যেহেতু AP2A এবং SOX10 হল প্রারম্ভিক স্থানান্তরিত NCC-এর চিহ্নিতকারী, তাই ইতিবাচক দাগ ইঙ্গিত করে যে এই কোষগুলি স্থানান্তর-পরবর্তী CNCC যা E9.5 দ্বারা স্তরিত করা যায় না।
আমাদের ডেটা পরামর্শ দেয় যে SPECC1L দ্বারা AJ এর আণবিক নিয়ন্ত্রণ PI3K-AKT সংকেত দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়।SPECC1L ঘাটতি কোষ এবং টিস্যুতে AKT সংকেত হ্রাস করা হয়।Fantauzzo এট আল দ্বারা অনুসন্ধান.ক্র্যানিওফেসিয়াল মরফোজেনেসিস-এ PI3K-AKT সিগন্যালিংয়ের জন্য সরাসরি ভূমিকা সমর্থন করে।(2014) দেখিয়েছে যে PDGFRα-ভিত্তিক PI3K-AKT সংকেত সক্রিয়করণের অভাব একটি ক্লেফ্ট প্যালেট ফেনোটাইপের দিকে নিয়ে যায়।আমরা আরও দেখাই যে PI3K-AKT পথের বাধা U2OS কোষগুলিতে AJ এবং কোষের আকার পরিবর্তন করার জন্য যথেষ্ট।আমাদের অনুসন্ধানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, কেইন এট আল।37 দেখিয়েছে যে এন্ডোথেলিয়াল কোষে PI3K α110 সাবইউনিটের ডাউনরেগুলেশনের ফলে পেরিসেলুলার β-ক্যাটেনিন স্টেনিংয়ের অনুরূপ বৃদ্ধি ঘটে, যাকে "সংযোগ সূচক" বৃদ্ধি হিসাবে উল্লেখ করা হয়।যাইহোক, এন্ডোথেলিয়াল কোষগুলিতে যাদের অ্যাক্টিন ফিলামেন্টগুলি ইতিমধ্যেই অত্যন্ত সংগঠিত, PI3K-AKT পথের দমনের ফলে একটি আলগা কোষের আকার হয়।বিপরীতে, SPECC1L-kd U2OS কোষগুলি একটি প্রসারিত কোষের আকৃতি দেখিয়েছে।এই পার্থক্য সেল টাইপ নির্দিষ্ট হতে পারে।যদিও PI3K-AKT সংকেত দমন স্থায়ীভাবে অ্যাক্টিন সাইটোস্কেলটনকে প্রভাবিত করে, কোষের আকারের উপর প্রভাব কেন্দ্রীয় অ্যাক্টিন ফাইবারগুলির ঘনত্ব এবং সংগঠনের পরিবর্তনের কারণে সৃষ্ট উত্তেজনার পরিবর্তন দ্বারা নির্ধারিত হয়।U2OS কোষগুলিতে, আমরা SPECC1L-ঘাটতি AJ পরিবর্তন এবং পুনরুদ্ধারের চিহ্নিতকারী হিসাবে শুধুমাত্র কোষের আকৃতি পরিবর্তন ব্যবহার করেছি।উপসংহারে, আমরা অনুমান করি যে SPECC1L এর ঘাটতিতে AKT পথের বাধা AJ স্থিতিশীলতা বাড়ায় এবং CNCC-তে বিচ্ছিন্নতা হ্রাস করে।
মজার বিষয় হল, AKT প্রোটিন স্থিতিশীলতা বা টার্নওভারের স্তরে PI3K-AKT সংকেত নিয়ন্ত্রণের পরামর্শ দিয়ে SPECC1L-এর অনুপস্থিতিতে phosphorylated 473-AKT মাত্রা ছাড়াও ভিট্রো এবং ভিভোতে প্যান-AKT স্তরগুলি হ্রাস করা হয়েছিল।SPECC1L এবং MID1 জিন, উভয়ই Opitz/GBBB সিন্ড্রোমের সাথে যুক্ত, প্রোটিন এনকোড করে যা মাইক্রোটিউবুলস 18,22 কে স্থিতিশীল করে।যে প্রক্রিয়া দ্বারা SPECC1L এবং MID1 মধ্যস্থতা করে মাইক্রোটিউবুল স্থিতিশীলতা সম্পূর্ণরূপে বোঝা যায় না।SPECC1L-এর ক্ষেত্রে, এই স্থিতিশীলতায় মাইক্রোটিউবুলস 18-এর একটি উপসেটের বর্ধিত অ্যাসিটাইলেশন অন্তর্ভুক্ত রয়েছে।এটা সম্ভব যে SPECC1L অন্যান্য প্রোটিন যেমন AKT কে স্থিতিশীল করার জন্য একটি অনুরূপ প্রক্রিয়া ব্যবহার করে।এটি দেখানো হয়েছে যে AKT প্রোটিনে লাইসিনের অবশিষ্টাংশের অ্যাসিটাইলেশন ঝিল্লি স্থানীয়করণ এবং ফসফোরিলেশন 38 হ্রাসের দিকে পরিচালিত করে।উপরন্তু, AKT-তে একই লাইসিন অবশিষ্টাংশে K63 চেইনের সর্বব্যাপীকরণ এর মেমব্রেন স্থানীয়করণ এবং সক্রিয়করণ 39,40 এর জন্য প্রয়োজন।বিভিন্ন উচ্চ থ্রুপুট ইস্ট টু-হাইব্রিড স্ক্রিনে চিহ্নিত SPECC1L প্রোটিনের সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করার বিভিন্ন কারণের মধ্যে, চারটি - CCDC841, ECM2942, APC এবং UBE2I43 - প্রোটিন টার্নওভার বা সর্বজনীনতা বা সুমায়িলেশনের মাধ্যমে স্থিতিশীলতার সাথে জড়িত।SPECC1L AKT লাইসিনের অবশিষ্টাংশের অনুবাদ-পরবর্তী পরিবর্তনের সাথে জড়িত হতে পারে, যা AKT স্থিতিশীলতাকে প্রভাবিত করে।যাইহোক, AKT প্রোটিনের স্থানীয়করণ এবং স্থিতিশীলতায় SPECC1L-এর গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা ব্যাখ্যা করা বাকি রয়েছে।
ভিভোতে SPECC1L এক্সপ্রেশনে গুরুতর ত্রুটিগুলির ফলে AJ মার্কার স্টেনিং এবং ত্রুটিপূর্ণ CNCC ওভারলে বৃদ্ধি পেয়েছে, সেইসাথে অ্যাপোপটোসিস এবং প্রাথমিক ভ্রূণের প্রাণঘাতীতা বৃদ্ধি পেয়েছে।পূর্ববর্তী প্রতিবেদনে দেখানো হয়েছে যে অ্যাপোপটোসিসের বর্ধিত মাত্রা সহ মাউস মিউট্যান্টগুলি নিউরাল টিউব ত্রুটি 44,45,46,47 এবং ক্র্যানিওফেসিয়াল ত্রুটিগুলির সাথে যুক্ত।এটি প্রস্তাব করা হয়েছে যে নিউরাল ভাঁজ বা ফ্যারিঞ্জিয়াল আর্চে অত্যধিক কোষের মৃত্যুর ফলে সঠিক মরফোজেনেটিক আন্দোলনের জন্য প্রয়োজনীয় কোষের অপর্যাপ্ত সংখ্যক হতে পারে 48,49,50।বিপরীতে, মাঝারিভাবে হ্রাস করা SPECC1L এক্সপ্রেশন সহ আমাদের SPECC1L ঘাটতি সেল লাইনগুলি কোষের মৃত্যুর বর্ধিত প্রমাণ ছাড়াই শুধুমাত্র AJ পরিবর্তনগুলি দেখায়।যাইহোক, এই Kd কোষগুলিতে PI3K-AKT পথের রাসায়নিক বাধার ফলে অ্যাপোপটোসিস বৃদ্ধি পেয়েছে।এইভাবে, SPECC1L এক্সপ্রেশন বা ফাংশনে একটি মাঝারি হ্রাস কোষের বেঁচে থাকা নিশ্চিত করে।এটি পর্যবেক্ষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে বিরল Specc11 মিউট্যান্ট ভ্রূণ যা সেন্ট এ গ্রেফতার এড়িয়ে যায়।E9.5—সম্ভবত জিন ক্যাপচারের কার্যকারিতা কমে যাওয়ার কারণে—তাদের নিউরাল টিউবগুলি বন্ধ করতে সক্ষম হয় এবং পরে বিকাশের সময় বন্ধ হয়ে যায়, প্রায়শই ক্র্যানিওফেসিয়াল ত্রুটি (চিত্র S3) সহ।এছাড়াও এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হল ক্র্যানিওফেসিয়াল অস্বাভাবিকতা সহ হেটেরোজাইগাস স্পেক১এল ভ্রূণের বিরল ঘটনা—সম্ভবত জিন ক্যাপচারের দক্ষতা বৃদ্ধির কারণে—সেইসাথে জেব্রাফিশের সন্ধান যাতে দুটি SPECC1L অর্থোলগ (স্পেক1এলবি) এর মধ্যে একটি লেটফেসিয়াল ভ্রূণের ক্ষতি করে। নিচের চোয়াল এবং দ্বিপাক্ষিক ফাটল51.সুতরাং, মানব রোগীদের মধ্যে চিহ্নিত হেটেরোজাইগাস SPECC1L লস-অফ-ফাংশন মিউটেশনগুলি ক্র্যানিওফেসিয়াল মরফোজেনেসিসের সময় SPECC1L ফাংশনে ছোট প্রতিবন্ধকতা সৃষ্টি করতে পারে, যা তাদের অরোফেসিয়াল ক্লেফ্টগুলি ব্যাখ্যা করার জন্য যথেষ্ট।আন্তঃকোষীয় যোগাযোগের SPECC1L-ভিত্তিক নিয়ন্ত্রণ প্যালাটোজেনেসিস এবং ফ্যারিঞ্জিয়াল আর্চের ফিউশনেও ভূমিকা পালন করতে পারে।SPECC1L ফাংশনের আরও অধ্যয়ন নিউরোএপিথেলিয়াল কোষের গতিশীলতা এবং ক্র্যানিওফেসিয়াল মরফোজেনেসিসে নিউরাল টিউব বন্ধের সময় CNCC-তে অস্থায়ী আন্তঃকোষীয় যোগাযোগের ভূমিকা ব্যাখ্যা করতে সাহায্য করবে।
U2OS অস্টিওসারকোমা নিয়ন্ত্রণ এবং SPECC1L-kd কোষগুলি পূর্বে বর্ণনা করা হয়েছে (সাদি এট আল।, 2011)।SPECC1L-এর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডিগুলিও পূর্বে চিহ্নিত করা হয়েছে (Saadi et al., 2011)।অ্যান্টি-β-ক্যাটেনিন অ্যান্টিবডি (খরগোশ; 1:1000; সান্তা ক্রুজ, ডালাস, TX) (মাউস; 1:1000; সেল সিগন্যালিং প্রযুক্তি, ড্যানভার্স, এমএ), মায়োসিন IIb (1:1000; সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , ক্যালিফোর্নিয়া), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; সেল সিগন্যালিং প্রযুক্তি, Danvers, MA), প্যান-AKT (1:1000; থার্মোফিশার সায়েন্টিফিক, ওয়ালথাম, এমএ ) , KI67 (1:1000; সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি, ড্যানভার্স, এমএ), ক্লিভড ক্যাসপেস 3 (1:1000; সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি, ড্যানভার্স, এমএ) এবং β-অ্যাক্টিন (1:2500; সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, MO ) বর্ণিত হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।.অ্যাক্টিন ফিলামেন্টগুলি অ্যাক্টি-স্টেইন রোডামাইন ফ্যালোইডিন (সাইটোস্কেলটন, ডেনভার, কলোরাডো) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল।
U2OS কন্ট্রোল সেল এবং SPECC1L-kd কোষগুলিকে 10% ভ্রূণের বোভাইন সিরাম (লাইফ টেকনোলজিস, কার্লসবাদ, CA) দিয়ে পরিপূরক উচ্চ গ্লুকোজ ডিএমইএম-এ সংস্কৃত করা হয়েছিল।AJ পরিবর্তনের জন্য, 0.1% পোরসিন জেলটিন (সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, MO) দিয়ে চিকিত্সা করা গ্লাসে 2 x 105 কোষের বীজ বপন করা হয়েছিল এবং কোষের আকারে পরিবর্তনের জন্য পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।কোষগুলি বিভিন্ন নির্দেশিত সময় পয়েন্টে সংগ্রহ করা হয়েছিল: বীজ বপনের 4 ঘন্টা পরে (t = 1), বীজ বপনের 24 ঘন্টা পরে (t = 2), কোষের আকারে পরিবর্তন ছাড়াই সঙ্গম (t = 3), কোষের আকারে পরিবর্তন (t = 4) , 24 ঘন্টা পরে কোষের আকৃতি পরিবর্তন (t = 5) এবং 48 ঘন্টা পরে কোষের আকৃতি পরিবর্তন (t = 6) (চিত্র 1, 2, 3)।PI3K-AKT পাথওয়েকে মডিউল করার জন্য, কোষগুলিকে PI3K-AKT ইনহিবিটর ওয়ার্টম্যানিন (TOCRIS বায়োসায়েন্সেস, মিনিয়াপোলিস, মিনেসোটা) বা SC-79 অ্যাক্টিভেটর (TOCRIS বায়োসায়েন্সেস, মিনিয়াপোলিস অ্যাডামস) দিয়ে নির্দেশিত ঘনত্বে সংস্কৃতি করা হয়েছিল।রাসায়নিক ধারণকারী মাধ্যম প্রতিদিন পরিবর্তন করা হয়.
স্বাভাবিক সংস্কৃতির অবস্থার অধীনে লাইভ কন্ট্রোল এবং কেডি সেলগুলিতে ফ্রেম-বাই-ফ্রেম রেকর্ডিং তৈরি করা হয়েছিল এবং ফেজ কনট্রাস্ট চিত্রগুলি 7 দিনের জন্য প্রতি 10 মিনিটে সংগ্রহ করা হয়েছিল।চিত্রগুলি একটি কম্পিউটার-নিয়ন্ত্রিত Leica DM IRB ইনভার্টেড মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে অর্জিত হয়েছিল যা একটি যান্ত্রিক পর্যায়ে সজ্জিত এবং একটি QImaging Retiga-SRV ক্যামেরার সাথে সংযুক্ত একটি 10 ​​× N-PLAN উদ্দেশ্য।ইমেজিংয়ের সময়, 5% CO2 সহ একটি আর্দ্র বায়ুমণ্ডলে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সেল সংস্কৃতি বজায় রাখা হয়েছিল।
আঞ্চলিক মিউট্যান্ট মাউস রিসোর্স সেন্টার (UC ডেভিস, CA) থেকে দুটি জিন ট্র্যাপ ES সেল লাইন DTM096 এবং RRH048 Specc11 ঘাটতি মাউস লাইন তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়েছিল, মনোনীত Specc1lgtDTM096 এবং Specc1lgtRRH046।সংক্ষেপে, 129/REJ ES কোষগুলি C57BL6 ব্লাস্টোসিস্টগুলিতে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।ফলস্বরূপ কাইমেরিক পুরুষ ইঁদুরগুলিকে মহিলা C57BL6 ইঁদুরের সাথে প্রজনন করা হয়েছিল আগুটি কোট রঙের সাথে সন্তানদের সনাক্ত করার জন্য।জিন ট্র্যাপ ভেক্টর সন্নিবেশের উপস্থিতি হেটেরোজাইগোট সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।ইঁদুরগুলি 129/REJ; C57BL6 এর মিশ্র পটভূমিতে রাখা হয়েছিল।জেনেটিক ট্র্যাপ ভেক্টরের সন্নিবেশ সাইটের অবস্থানটি RT-PCR, জিনোম সিকোয়েন্সিং এবং জেনেটিক পরিপূরক (পরিপূরক চিত্র 1) দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল।ডাবল হেটেরোজাইগাস স্পেসিক1এলজিটি ইঁদুরের সিএনসিসি বংশের সন্ধান করতে, ROSAmTmG (#007576) এবং Wnt1-Cre (#003829) ইঁদুরগুলি (জ্যাকসন ল্যাবরেটরি, বার হারবার, ME) ROSAmTmG এবং Wnt1-Crecry1-এ এমপিসিসিএল এমইউসিপিএল এমইউএস তৈরি করতে পার হয়েছিল।কানসাস মেডিকেল সেন্টার বিশ্ববিদ্যালয়ের ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি দ্বারা অনুমোদিত প্রোটোকল অনুসারে ইঁদুরের সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা করা হয়েছিল।
ঘরের তাপমাত্রায় 60 মিনিটের জন্য ভ্রূণগুলিকে (1% ফর্মালডিহাইড, 0.2% গ্লুটারালডিহাইড, 2 মিমি এমজিসিএল2, 0.02% এনপি-40, 5 মিমি ইজিটিএ) স্থির করা হয়েছিল।এক্স-গ্যাল স্টেনিং দ্রবণে ফিক্সেশনের পরে (5 মিমি পটাসিয়াম ফেরিসিয়ানাইড, 5 মিমি পটাসিয়াম ফেরোসায়ানাইড, 2 মিমি এমজিসিএল2, 0.01% সোডিয়াম ডিঅক্সিকোলেট, 0.02% এনপি-40, 1 মিলিগ্রাম/মিলি এক্স-গ্যাল) দাগের বিকাশ 3 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে সঞ্চালিত হয়েছিল .1-6 ঘন্টার মধ্যে °সে.ভ্রূণগুলিকে 4% পিএফএ-তে পোস্ট-ফিক্স করা হয়েছিল এবং ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল।
ওয়েস্টার্ন ব্লটিং-এর জন্য, কোষগুলিকে প্যাসিভ লাইসিস বাফারে (প্রোমেগা, ফিচবার্গ, WI) HALT প্রোটিজ ইনহিবিটরস (সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, MO) এর মিশ্রণের সাথে সম্পূরক করা হয়েছিল।লাইসেটগুলি 12% পলিঅ্যাক্রিলামাইড মিনি-প্রোটিন টিজিএক্স রেডিমেড জেলে (বায়ো-র্যাড, হারকিউলিস, সিএ) প্রক্রিয়া করা হয়েছিল এবং ইমমোবিলন পিভিডিএফ মেমব্রেনে (ইএমডি মিলিপুর, বিলেরিকা, এমএ) স্থানান্তরিত হয়েছিল।পিবিএস-এ 0.1% টুইন ধারণকারী 5% দুধে ঝিল্লিগুলি ব্লক করা হয়েছিল।অ্যান্টিবডিগুলি রাতারাতি 4 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে বা ঘরের তাপমাত্রায় এক ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল।ফেমটো সুপারসিগন্যাল ওয়েস্ট ইসিএল বিকারক (থার্মো সায়েন্টিফিক, ওয়াল্টহাম, এমএ) সিগন্যাল তৈরির জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।ইমিউনোস্টেইনিংয়ের জন্য, ভ্রূণগুলিকে রাতারাতি 4% পিএফএ/পিবিএস-এ স্থির করা হয়েছিল এবং ক্রাইওপ্রিজার করা হয়েছিল।টিস্যু ক্রায়োসেকশনগুলি পিবিএস-এ 1% সাধারণ ছাগলের সিরাম (থার্মো সায়েন্টিফিক, ওয়ালথাম, এমএ) এবং 0.1% ট্রাইটন এক্স-100 (সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, এমও) ধারণ করে ব্লক করা হয়েছিল এবং তারপরে একটি ইনকিউবেটরে 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউব করা হয়েছিল। রাতঅ্যান্টি-অ্যান্টিবডি এবং ফ্লুরোসেন্ট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (1:1000) সহ 4°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য।দাগযুক্ত বিভাগগুলি প্রোলং সোনার মাধ্যম (থার্মো সায়েন্টিফিক, ওয়ালথাম এমএ) এ স্থাপন করা হয়েছিল এবং লাইকা টিসিএস এসপিই কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে সমতল চিত্রগুলি প্রাপ্ত হয়েছিল।প্রতিটি ইমিউনোস্টেইনিং কমপক্ষে দুটি মিউট্যান্ট ভ্রূণের সিরোসেকশনে তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল।একটি প্রতিনিধি পরীক্ষা দেখানো হয়.
কোষগুলি পরিবর্তিত RIPA বাফারে (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% গ্লিসারল, 2 mM EDTA, এবং HALT প্রোটিজ ইনহিবিটর (সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুই)) এ ইনকিউবেট করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রোটিন জি ম্যাগনেটিক পুঁতি (লাইফ টেকনোলজিস, কার্লসব্যাড, সিএ) দিয়ে লাইসেটগুলিকে প্রিপিউরিফাই করা হয়েছিল এবং তারপর রাতারাতি 4° সেন্টিগ্রেডে ইনকিউব করা হয়েছিল। অ্যান্টি-SPECC1L বা IgG প্রোটিন G প্রোটিন পুঁতিগুলি SPECC1L বের করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল এবং অ্যান্টি ব্যবহার করে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং করা হয়েছিল। উপরে বর্ণিত -β-কেটিনিন অ্যান্টিবডি দেখানো সহ-আইপি পরীক্ষাগুলি চারটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধি।
কানসাস মেডিকেল সেন্টার ইউনিভার্সিটির ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি সেন্টারে ফিক্সড কালচারড সেল বা মাউস ভ্রূণের টিস্যু সরবরাহ করা হয়েছিল।সংক্ষেপে, নমুনাগুলি EMbed 812 রেজিনে (ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি সায়েন্সেস, ফোর্ট ওয়াশিংটন, PA) এম্বেড করা হয়েছিল, রাতারাতি 60°C তাপমাত্রায় পলিমারাইজ করা হয়েছিল এবং একটি ডায়মন্ড ব্লেড দিয়ে সজ্জিত একটি Leica UC7 আল্ট্রামাইক্রোটোম ব্যবহার করে 80 nm এ বিভাগ করা হয়েছিল৷একটি 100 kV ল্যাব6 বন্দুক দিয়ে সজ্জিত একটি JEOL JEM-1400 ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে বিভাগগুলি কল্পনা করা হয়েছিল।
এই নিবন্ধটি কীভাবে উদ্ধৃত করবেন: উইলসন, এনআর এবং অন্যান্য।SPECC1L এর ঘাটতি বিভক্ত জয়েন্টগুলির স্থিতিশীলতা বৃদ্ধি করে এবং ক্র্যানিয়াল নিউরাল ক্রেস্ট কোষগুলির হ্রাস হ্রাস করে।বিজ্ঞান.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016)।
সেন্ট-জিন, জে-পি।নিউরাল ক্রেস্টের আবেশ এবং পার্থক্য।(স্প্রিংগার সায়েন্স + বিজনেস মিডিয়া; ল্যান্ডস বায়োসায়েন্স/ইউরেকাহ ডটকম, 2006)।
কর্ডেরো, ডিআর এট আল।ক্র্যানিয়াল নিউরাল ক্রেস্ট কোষগুলি গতিশীল: ক্র্যানিওফেসিয়াল বিকাশে তাদের ভূমিকা।আমেরিকান জার্নাল অফ মেডিকেল জেনেটিক্স।পার্ট A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011)।
বোল্যান্ড, আরপি নিউরোক্রিস্টোপ্যাথিয়া: 20 বছর ধরে এর বৃদ্ধি এবং বিকাশ।শিশু বিশেষজ্ঞ।প্যাথলজিপরীক্ষাগারওষুধ.17, 1-25 (1997)।
ম্যাঙ্গোল্ড ই., লুডভিগ কেইউ এবং নোটেন এমএম ব্রেকথ্রু অরোফেসিয়াল ক্লেফ্টের জেনেটিক্সে।মলিকুলার মেডিসিনের প্রবণতা 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011)।
মিনু, এম. এবং রিলে, এফএম ক্র্যানিয়াল নিউরাল ক্রেস্ট সেল মাইগ্রেশন এবং ক্র্যানিওফেসিয়াল বিকাশের সময় প্যাটার্নিংয়ের আণবিক প্রক্রিয়া।উন্নয়ন 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010)।
ডিক্সন, এমজে, মারাজিটা, এমএল, বিটি, টিএইচ এবং মারে, জেকে ক্লেফ্ট ঠোঁট এবং তালু: জেনেটিক এবং পরিবেশগত প্রভাব বোঝা।স্বাভাবিক মন্তব্য।জেনেটিক্স 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011)।
ইনগ্রাম, সিআর এবং অন্যান্য।ইন্টারফেরন-নিয়ন্ত্রক ফ্যাক্টর-6 (Irf6)-এর ঘাটতি ইঁদুরে ত্বক, অঙ্গপ্রত্যঙ্গ এবং ক্র্যানিওফেসিয়াল অঞ্চলের অস্বাভাবিক মরফোজেনেসিস।জাতীয় জেনেট।38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006)।
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3 এর প্রভাবশালী মিউটেশন ভ্যান ডার ওয়ার্ড সিন্ড্রোম সৃষ্টি করে এবং মৌখিক পেরিডার্মের বিকাশকে ব্যাহত করে।Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014)।
হ্যারিস, এমজে এবং জুরিলফ, ডিএম নিউরাল টিউব বন্ধের ত্রুটি সহ মাউস মিউট্যান্টদের তালিকা আপডেট করুন এবং নিউরাল টিউব বন্ধের সম্পূর্ণ জেনেটিক বোঝার দিকে অগ্রগতি করুন।জন্মগত ত্রুটির তদন্ত।পার্ট A, ক্লিনিক্যাল এবং মলিকুলার টেরাটোলজি 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010)।
ফান্টাউজো, কেএ এবং সোরিয়ানো, পি. PI3K-মধ্যস্থিত PDGFRalpha সিগন্যালিং p53-নির্ভর আন্তঃকোষীয় পথের মাধ্যমে কঙ্কালের বিকাশে বেঁচে থাকা এবং বিস্তারকে নিয়ন্ত্রণ করে।জিন ডেভেলপমেন্ট 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014)।
কোপ, এজে, গ্রিন, এনডি এবং মারডক, জেএন ডিশেভেলড: রিলেশন অফ কনভারজেন্ট এক্সপেনশন টু নিউরাল টিউব ক্লোজার।নিউরোলজিতে প্রবণতা।26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003)।